| Summary: | En el presente trabajo de Tesis se estudian las proteínas GmsPLA2-XIA-l y GmsPLA2-XIB-2, sPLA2 de soja (Glycine max), las cuales catalizan la hidrólisis del enlace sn-Z de fosfolípidos dando como producto ácidos grasos y lisoderivados (Capítulo 1). En el grupo de investigación del Dr. Ricardo Madoery (Facultad de Ciencias Agropecuarias, UNC) se determinó la presencia de actividad PLA2 en extracto de semillas de soja, a partir de la cual la enzima fue parcialmente purificada y caracterizada. La sPLA2 resultó ser una enzima de reducida masa molecular (alrededor 13 kDa), con una dependencia milimolar de calcio para su actividad, pH óptimo ligeramente básico, estabilidad elevada frente al calor, estimulación por auxinas y probable modo catalítico saltatorio (hopping) de acción en presencia de vesículas multilamelares enriquecidas parcialmente por fosfolípidos aniónicos provenientes de lecitina de soja. Algunas de estas características son compatibles con otras sPLA2s. A pesar de haber sido determinada actividad PLA2 en extracto de semillas de soja, no se pudo determinar la identidad de la enzima purificada, hecho que motivó en este trabajo de Tesis, una búsqueda bioinformática de los genes probables, a los [mes de aseverar la existencia de este tipo de enzimas en soja (Glycine max) (Capítulo 3). Frente a la hipótesis de la existencia de isoformas de PLA2 que pudieran tener masas moleculares próximas que dificultaran la determinación de la identidad mediante secuenciamiento: de la proteína purificada, se planteó la obtención de una proteína recombinante a los fines de poder estudiada con mayor detalle molecular (Capítulo 4). Para resumir, inicialmente se describió la presencia de 5 isoformas sPLA2 en el genoma de Glycine max, cuyas secuencias fueron analizadas encontrándose que las mismas poseían características propias de sPLA2s. Además se las clasificó dentro de la superfamilia de las sPLA2s de plantas, ubicando tres de ellas en el subgrupo XIA y dos en el subgrupo XIB. Esta subdivisión se basó en las características halladas en la triada catalítica, secuencia N- terminal y diferencias en el sitio de unión a calcio (Capítulo 3). También se determinó la estructura 3D de GmsPLA2-XIA-l mediante modelado por homología y dinámica molecular, y se identificaron los aminoácidos que estarían formando la "i-face" o superficie de reconocimiento interfacial. Se sabe que estos aminoácidos difieren entre las proteínas, incluso dentro de la misma familia y subgrupo. Este estudio permitió junto con otros resultados obtenidos en esta Tesis, avanzar en la comprensión de las propiedades de asociación interfacial de las sPLA2 de soja (Capítulo 3). Dos de las 5 iso formas presentes en el genoma de Glycine max, llamadas GmsPLA2-XIA-l y GmsPLA2-XIB-2, fueron seleccionadas en base a diferencias en sus masas moleculares y secuencia primaria, a los fines de ser caracterizadas a nivel bioquímico y estructural, avanzando así con el objetivo de obtener información acerca de aspectos estructurales, moleculares y cinéticos relacionados con las propiedades de asociación interfacial de sPLA2 de soja (Capítulo 4 y 5). Durante el desarrollo de los estudios que se presentan en esta Tesis, una etapa clave en el proceso de purificación de PLA2 fue la cromatografía en columna de afinidad por níquel. Así la afinidad enzima-ligando resultó clave en la purificación e identificación de este tipo de proteínas, las cuales han demostrado ser difíciles de obtener hasta homogeneidad usando otros sistemas de purificación. Para la medición de actividad se empleó un método espectro foto métrico específico, sensible y discontinuo, que permitió determinar el progreso de la reacción de hidrólisis de fosfolípidos, presentes en micelas mixtas, catalizada por las sPLA2 purificadas. Este método resultó adecuado para el control de actividad enzimática durante las distintas etapas de purificación de la enzima sPLA2 de soja y su posterior caracterización bioquímica (Capítulo 5). Todos los estudios de caracterización empleando la metodología que se menciona arriba, resultaron coherentes con las propiedades esperadas para una enzima del tipo sPLA2: reducida masa molecular, requerimiento micromolar de calcio, estabilidad frente a la temperatura, pH óptimo relativamente neutro. En este trabajo, a partir de medidas tanto a través de la actividad utilizando micelas mixtas como la espectroscopia de fluorescencia de triptófano, que brinda idea sobre la conformación general, se ha encontrado que el calcio es importante para la estabilidad térmica de GmsPLA2-XIA-1. Los resultados obtenidos con estas técnicas coincidieron con los obtenidos mediante dinámica molecular (Capítulo 3 y 5). Además, el estudio cinético utilizando micelas mixtas reveló un comportamiento michaeliano, sugiriendo que sPLA2s de soja tienden a actuar en modo hopping o saltatorio de catálisis interfacial (Capítulo 5). Esto, junto a una preferencia por sustrato diferente a la observada para otras sPLA2s, podría indicar diferencias estructurales a nivel de la superficie de reconocimiento interfacial la cual sería responsable a su vez de las diferencias catalíticas observadas. Estas observaciones sustentan la hipótesis principal que guió este trabajo de investigación con la posibilidad de establecer una correlación entre la composición amino-acídica de la "i-face" con las propiedades catalíticas interfaciales (parámetros cinéticos aparentes) de las GmsPLA2s. Mediante la técnica de capas lipídicas monomoleculares, se demostró que la actividad de estas enzimas depende de la presión lateral de superficie o del empaquetamiento de los lípidos en interfaces (Capítulo 6). Una de las hipótesis de este trabajo de Tesis consistió en determinar si el efecto de las auxinas, fitohormonas presentes en plantas, sobre la actividad lipolítica de PLA2 es directo sobre la enzima o más bien un efecto en el cambio de la "calidad interfacial", Por ello, se estudió el comportamiento de auxinas en monocapas de DLPC observándose que tienen capacidad de penetrar y permanecer en la interface lipídica, así como también estimular la actividad sPLA2. En micelas mixtas, también se observó una estimulación de la actividad sPLA2 por auxinas (Capítulo 5 y 8). Los resultados citados fueron obtenidos mediante el empleo de un conjunto de técnicas aplicadas a los diferentes sistemas experimentales entre los cuales es de principal importancia la utilización de sistema de capas monomoleculares sobre interfaces aguaaire, sistema de micelas mixtas y espectroscopia de fluorescencia de triptófano. El trabajo de Tesis que se expone a continuación ha sido organizado de la siguiente manera: primero el Capítulo 1, que contiene la Introducción en la cual se describen todos los conocimientos y antecedentes que consideramos relevantes en relación a las características de las sPLA2 y se plantean los objetivos de este trabajo de Tesis. Los detalles metodológicos sobre cada técnica además de una breve fundamentación en cada caso se encuentran en la sección Experimental, en el Capítulo 2. A continuación se encuentran desarrollados los Capítulos 3 al 7 que contienen Resultados, Discusión y Conclusión y finalmente el Capítulo 8 donde se exponen las Conclusiones Generales.
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