| Summary: | En este trabajo de tesis trabajamos con los factores de transcripción de expresión temprana Fra-1 principalmente, y en menor medida con c-Jun y c-Fos. Estas proteínas forman parte de la familia Jun cuyos miembros son c-Jun, JunB y JunD y la familia Fos cuyos miembros son c-Fos, FosB, FosB2, Fra-1 y Fra-2. Todas ellas poseen en su secuencia de aminoácidos un motivo que se denomina bZip formado por residuos de leucinas, precedidos de una región rica en aminoácidos con carga positiva, BD, la cual le permite la interacción con moléculas de ADN. A partir de los antecedentes conocidos en relación a las características anfitrópicas para c-Fos y c-Jun, propusimos como objetivo general, profundizar nuestro conocimiento sobre propiedades interfaciales de factores de transcripción de expresión temprana en relación a los aspectos moleculares que modulan su interacción con membrana. Se estudió el comportamiento molecular de Fra- 1 en interfases y en presencia de diferentes fosfolípidos de membrana, como así también, la posible modulación por parte de Fra- 1 y c-Jun de la actividad fosfolipasa de las enzimas que fueron ensayadas previamente para c-Fos. También se logró caracterizar las diferentes regiones de la secuencia de c-Fos desde el punto de vista biofisico implementando mutantes de deleción de la proteína. Mediante técnicas de monocapa demostramos que Fra- 1 es una proteína altamente anfitrópica, flexible y muy estable en la interfase, características que comparte con c-Fos y c-Jun, mediante las cuales pueden ser distinguidas en interfases. Fra-1 mostró capacidad para distinguir la naturaleza del fosfolípido al cual se enfrenta en la interfase, mostrando mayor afinidad por fosfolípidos ácidos COMO PIP2, PS y PG, que por fosfolípidos neutros como PC, siendo mas estabilizada en esta última interfase cuando se encuentra con una organización expandida. También demostramos que los sistemas interfaciales bimoleculares formados por las proteínas Fra-1, c-Fos y c-Jun con componentes de membrana como los son los fosfolípidos PIP2, DLPC y esfingomielina, adoptan una organización topográfica definida para cada par con características propias para cada una de ellas. Estudiamos la modulación de la actividad fosfolipasa de las enzimas anfitrópicas PLA2, PLC y esfingomielinasa por parte de las proteínas Fra-1 y c-Jun en interfases formadas por mezclas 41 P á g in a Resumen bimoleculares con los sustratos correspondientes destacando una notable activación de la PLC en presencia de Fra-! y una inhibición inespecífica de las tres enzimas modulada por c-Jun. Las proteínas Fra-1, c-Fos y c-Jun son del tipo intrínsecamente desplegadas (IUP5), altamente hidrofóbicas y no han sido relacionadas con fenómenos de remodelación de membrana como aposición, hemifusión, fusión o permeabilización, como si han sido relacionadas otras IUPs. Por lo tanto se estudió las propiedades de las proteínas Fra- 1 y c-Fos en cuanto a su capacidad de inducir este tipo de remodelaciones en membrana de vesículas en fase fluida de DMPC con y sin PIP2. Mediante ensayos independientes de Transferencia de Energía Resonante y Microscopia Electrónica de Transmisión, demostramos el efecto que inducen estas proteínas en membrana de vesículas. Pudimos observar un porcentaje elevado de aposición de membranas inducido por Fra-1 y c-Fos con un cierto grado de hemifusión dependiendo de las condiciones de trabajo, como así también permeabilización de las membranas. Para realizar los experimentos que se describen en este trabajo, hemos utilizado técnicas de monocapa simples o acopladas a microscopio de epifluorescencia, ensayos de transferencia de energía resonante y ensayos de microscopía electrónica de transmisión en vesículas unilamelares grandes de 100 nm, además de técnicas de biología molecular para la construcción de las mutantes de deleción de c-Fos.
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