Summary: | Resumen En el presente trabajo de tesis se evaluaron, a partir de conceptos sobre dinámica de la organización supramolecular, la estructura y estabilidad de mezclas lipídicas constituidas por aceites naturales, fosfolípidos y ceras, con el objetivo de obtener bases racionales que permitieran formular nanopartículas lipídicas capaces de vehiculizar sustancias de interés biológico. Entre estas últimas se encuentran enzimas (solubles), aplicables en terapias sustitutivas, tales como la p-galactosidasa (p-Gal), cuya asociación con la nanopartícula puede llevar a la modulación de su actividad catalítica y de esta manera condiciona la formulación a seleccionar. Es importante tener en cuenta que, en las fuentes naturales de lípidos (grasas, aceites, ceras, etc) es posible encontrar un número pequeño de "tipos" de lípidos. Sin embargo, un mismo tipo de lípido puede variar en la naturaleza química de sus cadenas hidrocarbonadas (i.e., el grado de insaturación, longitud y posición de las cadenas hidrocarbonadas en la molécula) produciendo una gran cantidad de "variantes" moleculares que pueden producir dramáticas diferencias en el comportamiento del conjunto. En consecuencia, se abordó la complejidad composicional de las mezclas lipídicas complejas por medio de la búsqueda de parámetros moleculares promedio que tomaran en cuenta esta variabilidad molecular, sin desconocer que en sistemas complejos pueden emerger propiedades ausentes en los componentes individuales Los análisis de interacciones intermoleculares y miscibilidad se realizaron primeramente utilizando mezclas de fosfolípido (dpPC o fosfatidil colina de huevo, EPC) y triglicéridos (de aceites de olivo, soja y nuez) en el modelo de capas monomoleculares en la interfase agua-aire, a las que se denominó "pseudo-binarias" con el fin de destacar que al menos uno de los "componentes" era una mezcla de variantes moleculares cuyo comportamiento se asumía como ideal. El análisis de miscibilidad de estos sistemas "pseudo-binarios", basado en las transiciones de bidimensionales de fase, permitió predecir el tipo de estructura de autoagregación esperable al dispersar estos lípidos en medio acuoso. Además, un análisis del componente principal permitió resolver el problema de correlación múltiple que significó asociar una variedad de parámetros experimentales (presión de colapso, área molecular promedio) con parámetros moleculares promedio composicionalmente ponderados que reflejan la longitud e insaturación de la fuente lipídica (Capítulo II). En el Capítulo III se estudiaron las dispersiones acuosas de las mezclas pseudo-binarias de PC/TG, y por medio de anisotropía de fluorescencia de sondas que se localizan en regiones hidrofóbicas e interfasiales (interfase lípido-agua), dispersión dinámica de la luz y calorimetría diferencial de barrido se evaluó la correlación estructura-composición, sugiriéndose la transición desde las estructuras de bicapa, ampollas intra-bicapa y partículas de emulsión a medida que crece la fracción molar de aceite (TG) respecto a la de fosfolípido. Estos resultados experimentales por un lado avalan las predicciones teóricas realizadas en el Capitulo II y por otro produjeron, hasta donde nosotros sabemos, la primera evidencia experimental de la existencia de "ampollas" de TG en el "core" hidrofóbico de las bicapas, las cuales han sido propuestas contemporáneamente por otros autores a partir de estudios de dinámica molecular. El interés por incorporar en la formulación a moléculas capaces de reducir la oxidación de lípidos (en este caso monoésteres de cadena larga o esteres de cera), llevó a estudiar primeramente la termodinámica de mezclas de PCs con cera de jojoba cuya capacidad antioxidante ya había sido reportada. Además de interpretaciones a partir de la termodinámica de mezclas, estos estudios involucraron análisis electrostáticos y espectroscopias avanzadas (PM-IRRAS) que contribuyeron a proponer un modelo de conformación que adopta la cera en la interfase, a explicar su baja estabilidad interfasial y su estabilización inducida por la mezcla con PC. En conjunto con datos publicados sobre el comportamiento de mezcla de J+TG, estos resultados sirvieron para comprender los estudios de mezclas pseudo-ternarias y a la construcción de un diagrama de fases pseudo-ternario a partir de los datos experimentales (Capítulo IV). Por último (Capítulo V), se evaluó la modulación de la actividad de p-Gal en presencia y en ausencia de dispersiones de lípidos con composiciones cuya selección, tendiente a tener representadas todos los tipos de estructura descriptas, se realizó a partir del diagrama de fases pseudo-ternario. Debido a la imposibilidad de lograr la micelización de todas estas partículas dispersas, tal como se había realizado en trabajos previos de nuestro grupo donde se estudió e! efecto modulatorio de fosfolípidos autoagregados en bicapas, no fue posible aplicar la espectrofotometría como técnica de análisis de la actividad catalítica. En consecuencia se aplicó la calorimetría de titulación isotérmica. Así, se determinaron los valores de los parámetros cinéticos en cada condición experimental. La diversidad de fases hidrofóbicas y a su vez el diferente grado de empaquetamiento molecular que presentan las suspensiones aquí utilizadas, serían responsables de una partición diferencial del producto de la reacción así como de la adsorción o penetración de la enzima, lo cual se reflejaría en la variabilidad en la magnitud de los parámetros cinéticos que se determinaron. Estas observaciones servirán de base para formular hipótesis acerca de la modulación de la velocidad de una reacción catalizada por una enzima en base a la composición de las suspensiones lipídicas.
|