Participación de vías de señalamiento intracelulares en la regulación transcripcional y funcional del factor de transcripción ZEB1 : implicancias en la progresión del cáncer de mama
Tesis (Doctor en Ciencia Químicas) – Universidad Nacional de Córdoba, 2013.
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2024
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| description | Tesis (Doctor en Ciencia Químicas) – Universidad Nacional de Córdoba, 2013. |
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| publishDate | 2024 |
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| spelling | rdu-unc.5544892024-12-06T06:24:10Z Participación de vías de señalamiento intracelulares en la regulación transcripcional y funcional del factor de transcripción ZEB1 : implicancias en la progresión del cáncer de mama Lorenzatti, Guadalupe Cabanillas, Ana María de Los Angeles Bocco, José Luis Borioli, Graciela A. Nores, Gustavo Alejandro Coso, Omar Transcripción genética Neoplasias de la Mama Factores de transcripción Tesis (Doctor en Ciencia Químicas) – Universidad Nacional de Córdoba, 2013. Fil: Lorenzatti, Guadalupe. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. ZEB1 es un factor de transcripción (ET) involucrado en la diferenciación mesodérmica y la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) en cáncer, el cual se expresa como dos isoformas fosforiladas. La pérdida de CCN6, una proteína moduladora de la vía del factor de crecimiento insulino-símil tipo 1 (IGF- 1), dispara la EMT y la expresión de ZEB1 en células mamarias epiteliales humanas (HME). Sin embargo, los roles de la fosforilación y la vía de señalamiento CCN6-IGF-1 en la regulación la actividad biológica de ZEB1, son desconocidos. Ensayos de cambio en la movilidad electroforética y estudios de genes reporteros probaron que la disminución en la fosforilación de ZEB1 incrementa la unión y la represión transcripcional de ZEB1 por sus genes blanco. Análisis funcionales con mutantes no fosforilables mostraron que la fosforilación por PMA/lonomicina (activador de PKC) o IGF-1 previenen la represión transcripcional por ZEB1. La inmunoprecipitación en lisado de células CHO-K1 reportó a ZEB1 como una proteína de interacción de MEK/ERK1-2. Incubaciones con inhibidores/activadores de vías de señalización bioquímicas probaron que la fosforilación de la T867 en ZEB1 por IGF-1/MEK-ERK bloquea su localización nuclear y actividad transcripcional. En un modelo tumoral, la proteína recombinante CCN6 (rhCCN6) fue suficiente para disminuir los niveles de ZEB1 en células HME con deficiencia en CCN6 (CCN6 KD) y MDA-MB-231 de cáncer de mama, disminuyendo su capacidad invasiva y proliferativa. La carencia de CCN6 indujo la secreción de IGF-1 por las células HME; efecto revertido por la adición de rhCCN6. La inhibición del receptor de IGF-1 (IGF-1R) demostró que la sobreexpresión de ZEB1 por pérdida de CCN6 requiere de la activación de la vía dependiente del GE-1R. rhCCN6 también inhibió la expresión de ZEB1 inducida por IGF-1 en células MIDA-MB-231. En muestras de carcinomas mamarios invasivos, la concomitante pérdida de CCN6 con la elevada sobreexpresión de IGF-1 ARNm correlaciona con inmunopositividad de FTs EMT-relacionados, ZEB1 o Snaii (test exacto de Fisher, p= 0,0114). Estos resultados permitieron identificar i) sitios de fosforilación clave en ZEB1, blanco de la vía MEK/ERK y, ji) una nueva vía reguladora, dependiente de IGF-1, a través de la que CCN6 actúa para limitar la expresión de ZEB1, la EMT y la progresión en cáncer de mama. PALABRAS CLAVE: ZEB1, dominio carboxilo-terminal, vías de señalización, fosforilación, células epiteliales de ovario, células epiteliales de mama, transición epitelial-mesenquimatosa, cáncer de mama. xi ZEB1 is a transcription factor (TE) involved in the mesoderm differentiation and the epithelial-tomesenchymal transition (EMT) in cancer; which is expressed as two phosphorylated isoforms. Knockdown of CCN6, a protein modulating the insulin-Iike growth factor-1 (IGE-1) pathway, triggers EMT with upregulation of ZEB1 in human mammary epithelial celis (HME). However, the roles of phosphorylation and the CCN6-IGF-1 signaling in the regulation of ZEB1 biological activity are unknown. Electrophoretic mobility shift assay and gene reporter studies proved that a decrease in ZEB1 phosphorylation increase both DNA binding and transcriptional repression of ZEB1 target genes. Eunctional analysis of non-phosphorylatable mutants show that phosphorylation by PMA/ionomycin (PKC activator), or by IGF-1, can prevent the transcriptional repression by ZEB1. lmmunoprecipitation using a CHO-K1 celI lysate reported that ZEB1 is an interacting protein of MEK/ERK1-2. lncubations with activators and inhibitors of signaling pathways showed that IGF-1/MEK-ERK phosphorylation of a T867 of ZEB1 disrupted its nuclear localization and transcriptional activity. In a cancer model, human recombinant CCN6 (rhCCN6) protein was sufficient to downregulate ZEB1 levels in CCN6-deficient (CCN6 KD) HME celis and MDA-MB-231 breast cancer celis, decreasing invasion and proliferation. Kriockdown of CCN6 induced IGF-1 secretion in HME celis; this effect was reverted by rhCCN6 addition. Inhibition of the IGF-1 receptor (IGF-1R) revealed that ZEB1 upregulation due to CCN6 loss requires activation of IGE-1R signaling. rhCCN6 blunted IGF-1-induced ZEB1 upregulation in MDA-MB-231 celis. In invasive breast carcinoma samples, the concomitant loss of CCN6 and upregulation of IGF-1R mRNA levels is associated with EMT-TEs, ZEB1 or Snail, immunopositivity (Fisher's exact, p= 0.0114). These results identified that 1) ZEB1 harbors key phosphorylation sites which are likely targets of MEK/ERK pathway and, ji) the IGE-1 signaling is a novel modifier through which CCN6 acts limiting ZEB1 expression, EMT and breast cancer progression. Fil: Lorenzatti, Guadalupe. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. 2024-12-05T16:54:43Z 2024-12-05T16:54:43Z 2013 doctoralThesis http://hdl.handle.net/11086/554489 spa Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ |
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