| Summary: | Las repeticiones de ADN y su metabolismo participan de procesos vitales para la adaptación y supervivencia tanto de especies procariotas como eucariotas; permiten también la reparación de ciertos tipos de daño al ADN, lo cual hace posible la conservación del genoma de cada una de estas especies. Estas repeticiones pueden ser reordenadas y generar distintos efectos fenotípicos, modificando y/o regulando la expresión de distintos genes. Existen evidencias de múltiples mecanismos encargados de reordenar repeticiones y estos pueden dividirse en dependientes e independientes de la recombinasa RecA. Esta proteína es el factor principal de la Recombinación homóloga, proceso durante el cual es capaz de catalizar la búsqueda de homología entre hebras y posteriormente el intercambio de cadenas, generando una nueva molécula híbrida. Los mecanismos independientes de RecA por su parte operan de distintas maneras, siendo sólo algunos ejemplos la “Unión de extremos no homólogos” (NHEJ), el “Intercambio de cromátida hermana” (SCE), el “Patinado de la polimerasa” y el “Apareamiento de simple hebra” (SSA). En particular, para el desarrollo de esta tesis nos concentraremos en los últimos dos, ya que tienen la mayor relevancia para los resultados obtenidos. El patinado de la polimerasa ocurre cuando la ADN polimerasa comienza la síntesis de una repetición y es detenida, lo cual ocasiona que la misma se disocie de la hebra de ADN y "salte" a la repetición contigua resumiendo la síntesis del ADN. De esta manera pueden generarse amplificaciones o deleciones de repeticiones (dependiendo de la hebra donde ocurra el “salto”). Se ha demostrado que tanto la longitud como la distancia entre las repeticiones afectan la frecuencia en la que puede patinar la polimerasa. Además, la presencia de repeticiones inversas flanqueando repeticiones directas puede contribuir a la parada de replicación, ya que estas generan estructuras secundarias del ADN como “loops” o “hairpins” que impiden la procesividad de la ADN polimerasa. El apareamiento de simple hebra (SSA), por otro lado, está relacionado con la reparación de DSBs que pueden generarse entre repeticiones directas del ADN. La resección bilateral de la simple hebra de ADN a partir de la ruptura permite exponer la región de homología entre las repeticiones y el posterior apareamiento de las mismas. De esta manera se repara la discontinuidad generada por el corte (letal para la célula) y se genera un producto final delecionado. El reordenamiento de repeticiones divergentes puede producir mutaciones, translocaciones y deleciones o inserciones, con el potencial de generar nuevos genes o funciones. Asimismo, se puede producir la inactivación de genes o cambios en su expresión. Es por esto que la regulación de este tipo de reordenamientos es crucial para la conservación de la integridad del genoma. Las proteínas MutS y MutL de E. coli (involucradas en el mecanismo de reparación de bases mal apareadas – MRS) tienen la capacidad de detectar bases mal apareadas en intermediarios de recombinación homóloga y catalizar la reversión del proceso, evitando la generación de productos recombinados con bases mal apareadas. Existen además, en organismos eucariotas, algunas evidencias de la acción regulatoria de MutS y sus homólogos sobre mecanismos independientes de RecA como los mencionados anteriormente. El objetivo general de este trabajo de Tesis se enfoca en el reordenamiento de repeticiones homólogas y homeólogas en P. aeruginosa, con particular interés en los mecanismos independientes de RecA. Para abordar este objetivo se utilizaron dos versiones de una construcción plasmídica conteniendo cada una, dos repeticiones homólogas u homeólogas conteniendo parte del gen que codifica la enzima beta galactosidasa. La deleción de parte de cada repetición puede generar una copia activa del gen de la enzima, cuya actividad puede ser detectada in situ. Utilizando esta construcción, se llevaron a cabo análisis in vivo y estudios in vitro a nivel molecular; por un lado se analizó el reordenamiento de repeticiones homólogas y homeólogas en cepas salvajes y mutantes de P. aeruginosa y E. coli mediante ensayos in vivo, y por otro lado se estudió la secuencia de nucleótidos de productos de reordenamiento, determinando sus posibles sitios de unión (entre repeticiones). Por último, se analizó la actividad beta galactosidasa de clones producto del reordenamiento. La medición de valores de tasa de deleción permitió determinar diferencias importantes entre E. coli y P. aeruginosa. Encontramos que más del 99% de las deleciones homólogas y el 95% de las deleciones homeólogas ocurren de manera dependiente de RecA en E. coli. En P. aeruginosa, por otro lado, mientras aproximadamente solo el 1% las deleciones homólogas ocurren de manera independiente a RecA, un porcentaje considerable (14%) de las deleciones homeólogas se dan independientemente de esta proteína. Por otro lado, reportamos por primera vez que la helicasa RadA cumple, en P. aeruginosa, un papel crucial en el reordenamiento de repeticiones homólogas y en menor medida en repeticiones homeólogas. Aún más, RadA estaría involucrada en la reparación del daño al ADN mediada por RecA. Demostramos también que las proteínas MutL y MutS son capaces de inhibir el reordenamiento in vivo entre repeticiones con un 5% de divergencia, y que MutS es capaz de regular aún con mayor eficiencia, dichos reordenamientos en ausencia de RecA. Los estudios de la secuencia de ADN y sitios de unión entre repeticiones aportaron aún más evidencias del control ejercido por MutS sobre el reordenamiento de repeticiones homeólogas, ya que en su ausencia se observa un número mayor de sitios de unión en una región con alta densidad de heterologías respecto a otra región libre de heterologías. Se encontraron además secuencias sin sitio de unión aparente, las cuales se observaron con significativamente mayor frecuencia en ausencia de RecA y MutL. Estos productos representan evidencia de un posible mecanismo de apareamiento de simple hebra (SSA) en P. aeruginosa, el cual estaría siendo regulado por la proteína MutL. Por último, los resultados obtenidos en esta tesis permitieron identificar un fenómeno que genera la pérdida de actividad beta galactosidasa en clones producto de reordenamiento a través de la deleción parcial o total del gen lacZ, demostrando en primer lugar que este proceso requiere de la helicasa RadA (ya que no se observan clones si actividad en su ausencia) y, en segundo lugar, que el mismo opera diferencialmente sobre repeticiones homeólogas y de manera independiente de la proteína RecA.
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