Estudio de las bases bioquímicas y moleculares de la resistencia contra la infección de Aspergillus producctores de aflatoxinas en la semilla de maní /

El objetivo general de la presente Tesis Doctoral fue identificar y comprender los mecanismos de resistencia de la semilla de maní frente a la infección con Aspergillus que permitan evitar la contaminación con aflatoxinas a campo, a través de la búsqueda de cultivares resistentes. Para ello el estudio fue dividido en la caracterización de dos vías de defensa: la de las lipoxigenasas (LOX) y la de los inhibidores de proteasas (IP). Los resultados obtenidos permitieron establecer una infección diferencial entre los cultivares ensayados. Las semillas del cultivar resistente Pi 337394, presentaron alta tolerancia a la infección con Aspergillus parasiticus y a la contaminación con aflatoxinas, mientras que las semillas del cultivar susceptible Florman mostraron elevada susceptibilidad. El análisis de la Vía de la LOX durante el proceso de infección a través de los estudios bioquímicos y moleculares realizados permitió afirmar que los productos de la LOX, 9-HPODE y 13-1-IPODE, actuarían como factores de resistencia y susceptibilidad respectivamente. Con la finalidad de dilucidar el control transcripcional de la vía en ambos cultivares durante la infección, fueron analizadas las expresiones de genes de LOX 2-3, LOX 4 y LOX 5. La resistencia a la infección aparenta estar relacionada a la respuesta temprana de 9-1-IPODE y de 13-1-IPODE, mediada por la expresión génica de las LOXs tipo 9-LOX y 13-LOX respectivamente. En el presente trabajo fueron propuestas dos nuevas LOXs: LOX 4 y LOX 5 como responsables de dichas acciones. Mientras que una respuesta meramente de una 13-LOX como es el caso de la LOX 2-3, estaría induciendo la infección. Por otra parte, la profundización en el estudio de la vía de IP permitió concluir que el cultivar resistente presentó actividad inhibitoria de tripsina incrementada. La identificación del perfil proteico con actividad inhibitoria demostraron diferencias entre ambos cultivares. En el resistente, fueron reconocidos los inhibidores de tripsina tipo Kunitz y tipo Bowman-Birk (BBTI) Al, Alt, BI y Bili, mientras que en cultivar susceptible solo se encontró el inhibidor de tripsina tipo Bowman-Birk BIlI y un inhibidor de proteasas. En cuanto a los estudios a campo de las vías de defensa se pudo concluir que la infección a campo con Aspergillus en semillas de maní resultó ser compleja y altamente dependiente de variables que no pudieron ser totalmente controladas como es el caso del estrés hídrico. El régimen de lluvia y aguas subterráneas afectaron el parámetro, junto con las temperaturas y otras variables no identificadas como la flora competente. La caracterización de la resistencia a la infección con Aspergillus y contaminación con aflatoxinas en el ensayo a campo, corroboró la descripción propuesta donde el cultivar Pi 337394 fue resistente y el Florman susceptible. Situación coincidente con la encontrada en los ensayos realizados in vitro. En lo referente a la Vía de la LOX, se demostró que a campo los cultivares del modelo de estudio propuesto han presentado diferencias en términos de expresión génica. De acuerdo a los resultados de la Vía de IP, el cultivar Florman presentaría en el momento de la cosecha una mayor respuesta a la infección, sin embargo la misma sería insuficiente como para inhibir la infección.
The overail aim of this Doctoral Thesis was to identify and understand the mechanisms of resistance of peanut seeds against infection with Aspergillus that avoid aflatoxin contamination in the field, through the search for resistant cultivars. This study was divided into the characterization of two defense pathways: the lipoxygenase (LOX) and the protease inhibitors (Pl). The results obtained allowed to establish a differential infection among the tested cultivars. The seeds of Pi 337394 cultivar showed high tolerance to infection with Aspergillus parasiticus and aflatoxin contamination, while seeds of Florman cultivar showed high susceptibility. Analysis of LOX pathway among infection through biochemical and molecular studies allowed claiming that the products of LOXs, 9-1-IPODE and 13 -HPODE, act as factors of resistance and susceptibility respectively. In order to elucidate the transcriptional control in both cultivars during infection, were analyzed gene expressions of LOX 2-3, LOX LOX 4 and 5. Resistance to infection appears to be linked to the early response of 9-1-IPODE and 13-1-IPODE, mediated gene expression of type 9- LOX and 13 - LOX respectively. In this work two novel genes were proposed: LOX 4 and 5 as the responsible for such actions. While a response of 13 -LOX such as LOX 2-3, would induce infection. The study of IP demostrated that the resistant cultivar showed increased trypsin inhibitory activity. Identification of the protein profile with inhibitory activity showed differences between cultivars. Trypsin inhibitor Kunitz and Bowman-Birk type (BBTI) Al, Ah, BI and BIlI were found in resistant cultivar while in susceptible cultivar only trypsin inhibitor Bowman -Birk BlIl and a protease inhibitor were found. In field studies, Aspergillus infection in peanut seeds revealed to be complex and highly dependent on variables that could not be fully controlled. The regime of rain and groundwater affected parameter, along with temperatures and other variables not identified as the competent flora. Characterization of resistance to Aspergillus infection and aflatoxin contamination in the field, demonstrated the hypothesis that Pi 337394 cultivar was resistant and Florman was susceptible. Coincident with the situation found in the ¡n vitro tests. LOX pathway, demonstrated differences in gene expression between both cultivars. The results obtained in IP studies revealed that Florman cultivar present in the harvest a greater response to infection, but it would be insufficient to inhibit Aspergillus infection and aflatoxin contamination.

• Main Author: Müller, Virginia Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas
• Other Authors: Asís, Ramón Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (Thesis advisor), Argaraña, Carlos Enrique Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (cths), Ferreyra, Nancy Fabiana Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Fisicoquímica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones en Fisicoquímica de Córdoba (cths), Wunderlin, Daniel Alberto Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Orgánica (cths), Asurmendi, Sebastián (evl)
• Format: Thesis Book
• Language: Spanish
• Published: Córdoba : [s. n.], 2014.
• Subjects: Mani; Aflatoxinas; Contaminación de alimentos; Aspergillus
• Item Description: Trabajo realizado en: Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología de Córdoba (CIBICI-CONICET). Departamento de Bioquímica Clínica. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de Córdoba.
• Physical Description: 158 h. : il. col. ; 30 cm. + 1 Archivo PDF : [recurso electrónico] ; 8,45 MB