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Bases celulares y moleculares de la autoinmunocompatibilidad en Nicotiana : organización y dinámica del citoesqueleto de F- actina y del sistema de endomembranas del tubo polínico durante el rechazo del polen incompatible/
La autoincompatibilidad (AI) es un mecanismo presente en la mayoría de las Angiospermas que permite el reconocimiento y rechazo del polen propio o genéticamente relacionado. De esta manera las plantas mantienen una apropiada variabilidad genética y previenen la endocría, lo que redunda en una mejor...
La autoincompatibilidad (AI) es un mecanismo presente en la mayoría de las Angiospermas que permite el reconocimiento y rechazo del polen propio o genéticamente relacionado. De esta manera las plantas mantienen una apropiada variabilidad genética y previenen la endocría, lo que redunda en una mejor adaptación a las condiciones cambiantes del medio ambiente. En la mayoría de las especies autoincompatibles el reconocimiento entre el polen y el pistilo está regulado genéticamente por el locus S. En Solanáceas este locus codifica las ribonucleasas S (S-RNasas) que se expresan en el pistilo y confieren la especificidad para el reconocimiento del polen. La acción citotóxica de estas S-RNasas también promueve la inhibición del crecimiento de los tubos polínicos incompatibles antes de que estos alcancen el ovario. La especie nativa Nicotiana alata ha sido utilizada como modelo experimental para dilucidar las bases moleculares de la AI dependiente de S-RNasas. Sin embargo en esta especie no existen estudios de AI en poblaciones naturales y por lo tanto la diversidad estructural y funcional de los alelos de S-RNasa es conocida de manera limitada. En esta tesis se identificaron y caracterizaron a nivel molecular y funcional nuevas secuencias de S-RNasas, denominadas S27, S70, S75, S107 y S210-RNasa, provenientes de una población natural de N. alata. Las distintas variantes alélicas de S-RNasa se expresaron de manera específica en el estilo de cada individuo analizado. Mediante análisis de segregación se demostró que estos genes son funcionales en el mecanismo de AI y constituyen, por lo tanto, alelos del locus S. Otras dos secuencias identificadas resultaron ser estructuralmente similares a las S-RNasas pero no funcionales en el sistema de AI y por lo tanto fueron denominadas NnSR1 y NnSR2 (Nicotiana non S-RNase). NnSR1 exhibió un patrón de expresión diferente a todos los alelos de S-RNasa y a NnSr2 lo que sugiere que este gen experimentó una evolución funcional diferente. El análisis filogenético confirmó que los alelos de S-RNasa de N. alata se encuentran distribuidos en varias líneas S transgenéricas cuya diversidad es anterior al proceso de especiación en Solanáceas. Un aspecto poco investigado en la AI dependiente de S-RNasas son los cambios a nivel subcelular que ocurren durante el rechazo del polen incompatible. En este trabajo de tesis se estudió mediante microscopía confocal de fluorescencia la estabilidad in vivo del citoesqueleto de F-actina y del sistema vacuolar de los tubos polínicos durante la respuesta de AI. En una fase temprana de la polinización, el 70% de los tubos polínicos compatibles e incompatibles mostraron un patrón organizado de F-actina consistente en largos filamentos paralelos al eje principal de la célula. Mientras que en las polinizaciones compatibles este patrón se mantuvo sin cambios durante todo el trayecto de los tubos polínicos hacia el ovario, Resumen FCQ-UNC 16 los tubos polínicos incompatibles sufrieron una progresiva desorganización de la F-actina. Experimentos de colocalización de F-actina y el sistema vacuolar de membranas revelaron que al día 6 posterior a la polinización incompatible alrededor del 80% de los tubos polínicos incompatibles mostraron la F-actina fragmentada, en tanto que un porcentaje similar mantenía intactos los compartimentos vacuolares. Estos resultados indican que durante la respuesta de AI, la fragmentación del citoesqueleto de F-actina precede a la disrupción de las membranas vacuolares. De esta manera, los tubos polínicos incompatibles son sometidos a un proceso de desorganización secuencial de las principales estructuras subcelulares. Los resultados también indican que el pool mayoritario de S-RNasas, endocitadas y almacenadas en las vacuolas de los tubos polínicos, serían liberadas al citoplasma en una fase tardía del rechazo del polen. Los estudios de integridad del citoesqueleto de F-actina y el sistema de endomembranas mediante microscopía de fluorescencia fueron extendidos a tubos polínicos crecidos in vitro en presencia de extractos de estilo compatibles e incompatibles. El sistema in vitro permitió estudiar de manera específica los cambios ocurridos en la zona apical del tubo polínico, extremadamente dificil de localizar en estudios in vivo. El crecimiento de los tubos polínicos en presencia de extracto incompatible fue 55% menor que en extracto compatible. Este menor crecimiento fue consistente con la ausencia del patrón normal de vesículas y la franja de actina de F-actina en el extremo apical, escenciales en la maquinaria de crecimiento polar del tubo polínico. La región subapical exhibió los cables de F-actina distorsionados y fragmentados junto a notables áreas de agregados vesiculares próximos a la membrana celular. Estas alteraciones alcanzaron al 85% de los tubos polínicos cultivados por 3 horas en extracto incompatible. Considerando en conjunto los experimentos in vivo e in vitro, los resultados obtenidos sugieren que el rechazo del polen incompatible transcurre en dos etapas: 1) una etapa temprana en donde las alteraciones en el citoesqueleto de F-actina y el tráfico de membranas producen el arresto del crecimiento del tubo y 2) una etapa tardía en la cual la disrupción vacuolar libera la S-RNasa al citoplasma para la degradación masiva del ARN del polen.
Item Description:
Trabajo realizado en: Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI). Departamento Bioquímica Clínica. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de Córdoba.
Physical Description:
164 p. : il. col ; 30 cm. + 1 Archivo PDF : [recurso electrónico] ; 9,07 MB
