Contribución de los péptidos antimicrobianos de la familia de las beta defensinas en la patogenia de la candidiasis vulvovaginal
Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2025
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2025
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| description | Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2025 |
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| spelling | rdu-unc.5573002025-08-27T15:16:30Z Contribución de los péptidos antimicrobianos de la familia de las beta defensinas en la patogenia de la candidiasis vulvovaginal Angiolini, Sofía Carla Sotomayor, Claudia Elena Rodríguez Galán, María Cecilia Smania, Andrea María Raimunda, Daniel César Di Genaro, María Silvia Candidiasis Bioquímica Enfermedades Urogenitales Femeninas y Complicaciones del Embarazo Microbios Péptidos beta-Amiloides Péptidos Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2025 Fil.: Angiolini, Sofia Carla. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Contribución de los péptidos antimicrobianos de la familia de las Beta Defensinas en la patogenia de la Candidiasis Vulvovaginal Candida albicans es un hongo comensal de las superficies mucosas y el principal agente etiológico de la candidiasis vulvovaginal aguda (CVVA) y su forma recurrente (CVVR), patologías que representan un importante problema de salud global. A pesar de los avances terapéuticos y del extenso conocimiento sobre los factores de riesgo y la adquisición de esta micosis, los mecanismos inmunológicos que regulan la respuesta antifúngica protectora a nivel vaginal aún no han sido completamente elucidados. Un desafío adicional en el manejo de estas infecciones es el aumento de la resistencia de Candida spp. a los antifúngicos convencionales, lo que limita la eficacia de las terapias actuales y resalta la necesidad de explorar nuevas estrategias terapéuticas. Este trabajo de tesis se enfocó en el estudio de los mecanismos inmunitarios locales implicados en el control de Candida spp., con especial atención en la función de las Beta Defensinas (BDs), péptidos con propiedades microbicidas, quimiotácticas e inmunomoduladoras. Métodos: para el desarrollo de este estudio, se emplearon distintas estrategias experimentales in vivo e in vitro. El modelo murino de Candidiasis Vulvovaginal (CVV) en ratones C57BL/6 se utilizó para evaluar la cinética de producción local de la BD1 murina (BD1m), de expresión constitutiva, y de la BD3 murina (BD3m), de carácter inducible, durante la infección vaginal por C. albicans SC5314. La expresión de estos péptidos se determinó mediante inmunofluorescencia indirecta en células epiteliales (CE) obtenidas de lavados cérvico vaginales de ratones infectados a distintos tiempos. Además, se emplearon modelos murinos de CVV en animales deficientes en el receptor A de la IL-17 (IL-17RA KO) y en el inflamasoma NLRP3 (NLRP3 KO), que permitieron evaluar la contribución de estas vías en la regulación de la BD1m y la BD3m durante el curso de la infección vaginal por C. albicans. Se analizaron los factores de virulencia y la resistencia antifúngica de aislados clínicos de pacientes con CVVA y CVVR, evaluando el dimorfismo fúngico, la adherencia (HSC), la capacidad formadora de biofilm (CFB) y la producción de enzimas hidrolíticas (proteinasas SAP y lipasas). También se determinó la sensibilidad a diferentes antifúngicos utilizados en el tratamiento de la vaginitis. Se utilizó un modelo in vitro de infección en CE de la línea celular HeLa para estudiar la regulación de las BD1 humana (BD1h) y BD3 humana (BD3h) luego de la exposición a C. albicans SC5314 y a aislados clínicos de pacientes con CVVA y CVVR previamente caracterizados. Para explorar si la expresión de BD1h y BD3h puede ser modulada por distintos agonistas, se emplearon ligandos de los receptores de la inmunidad innata TLR4, TLR1/2, TLR3, TLR9, Dectin-1 y C. albicans inactivadas por calor. Finalmente, se evaluó la actividad candidicida de BD1h recombinante (comercial) y BD3h recombinante producida mediante técnicas de ADN recombinante en E. coli. El gen de BD3h se insertó en el plásmido pMAL-c5E y se expresó como una proteína de fusión con MBP. La actividad antifúngica se determinó evaluando la capacidad candidicida de ambas defensinas en cultivo con el hongo y posterior recuento de Unidades Formadoras de Colonias (UFC). Resultados: En el modelo murino in vivo de CVV, la infección por C. albicans SC5314 indujo un reclutamiento temprano de neutrófilos, con niveles elevados de IL-1β y escasa concentración de IL-17A. A nivel tisular, se observó una marcada adherencia e invasión de C. albicans en el epitelio vaginal al D2 post infección (pi), con formación de hifas, infiltrado de PMNs y abscesos que se intensificaron con la progresión de la infección. En CE de lavados cervicovaginales, se detectó una mayor expresión de BD1m y BD3m, con un pico en el día D2 pi y una disminución progresiva en días posteriores. La inducción temprana de la expresión de la BD1m constitutiva fue dependiente de la activación del inflamasoma NLRP3, mientras que la expresión de BD3m fue regulada por la vía de señalización dependiente del receptor A de IL-17. Los ratones NLRP3 KO y los ratones IL-17RA KO mostraron niveles reducidos de BD1m y BD3m respectivamente, siendo esta disminución más marcada para la BD3m en los ratones IL-17RA KO, lo que resalta la importancia de estas vías en la inducción de estos péptidos antimicrobianos (PAMs) durante la respuesta inmune local frente a C. albicans. La caracterización de los factores de virulencia y la resistencia antifúngica de aislados clínicos de C. albicans provenientes de pacientes con CVVA y CVVR, permitió determinar la existencia de perfiles diferenciales de virulencia y una elevada resistencia a los azoles. Estos hallazgos sugieren que diferentes estrategias de virulencia podrían estar asociadas con las distintas formas clínicas de la infección. En los modelos in vitro con CE, la expresión de BD1h disminuyó significativamente tras la exposición a aislados clínicos de pacientes con CVVA y CVVR, mientras que la expresión de BD3h mostró una reducción de sus niveles dependiente de la cepa. Además, la activación de TLR4 indujo la producción tanto de BD1h como BD3h, mientras que la señalización a través del complejo TLR1/2 y de TLR3/TLR9 indujo solo la producción de BD3h. Finalmente, en relación a la actividad de los péptidos recombinantes como potencial alternativa terapéutica, la rBD1h mostró actividad candidicida contra la cepa C. albicans SC5314 y contra un aislado resistente al fluconazol proveniente de una paciente con CVVA, pero no fue efectiva contra un aislado de CVVR. En cuanto a la rBD3h, demostró actividad candidicida contra C. albicans SC5314. Ninguna de las defensinas recombinantes mostró citotoxicidad sobre células humanas. Conclusiones y aportes de este trabajo de tesis: Los hallazgos de este trabajo resaltan el papel de las BDs en la respuesta inmune innata del tracto genital femenino y su regulación diferencial a través de las vías de IL-17RA y NLRP3. La caracterización de los aislados clínicos sugiere la existencia de estrategias de virulencia específicas para los aislados vaginales provenientes de pacientes con CVVA y CVVR, lo que podría influir en la patogenia y el tratamiento de la infección. Dada la resistencia observada frente a azoles, drogas de elección para el tratamiento de la vaginitis por Candida, la actividad antifúngica de BD1h y BD3h sugiere su potencial como alternativa terapéutica en el contexto del aumento de la resistencia antifúngica, contribuyendo al desarrollo de estrategias más efectivas para el manejo de la CVVR. Candida albicans is a commensal fungus of mucosal surfaces and the main etiological agent of acute vulvovaginal candidiasis (AVVC) and its recurrent form (RVVC), conditions that represent a significant global health problem. Despite therapeutic advances and extensive knowledge about risk factors and the acquisition of this mycosis, the immunological mechanisms that regulate protective antifungal responses at the vaginal level remain incompletely understood. An additional challenge in managing these infections is the increasing resistance of Candida spp. to conventional antifungal drugs, which limits the efficacy of current therapies and highlights the need to explore new therapeutic strategies. This doctoral work focused on studying the local immune mechanisms involved in the control of Candida spp., with special attention to the role of Beta Defensins (BDs), peptides with microbicidal, chemotactic, and immunomodulatory properties. Methods: To carry out this study, various experimental in vivo and in vitro strategies were employed. The murine model of Vulvovaginal Candidiasis VVC in C57BL/6 mice was used to evaluate the kinetics of local production of murine beta defensin 1 (mBD1), which is constitutively expressed, and murine beta defensin 3 (mBD3), which is inducible, during vaginal infection by C. albicans SC5314.The expression of these peptides was evaluated by indirect immunofluorescence in epithelial cells (EC) obtained from cervicovaginal washes of infected mice at different time points. In addition, VVC models were used in mice deficient in the IL-17 receptor A (IL-17RA KO) and NLRP3 inflammasome KO (NLRP3 KO), which allowed the evaluation of the contribution of these pathways to BD1m and BD3m regulation during vaginal infection by C. albicans. Virulence factors and antifungal resistance of clinical isolates from AVVC and RVVC patients were analyzed, evaluating fungal dimorphism, adherence (HSC), biofilm-forming capacity (BFC), and the production of hydrolytic enzymes (SAP proteinases and lipases). Antifungal susceptibility to drugs commonly used in the treatment of vaginitis was also determined. An in vitro infection model using EC from the HeLa cell line was used to study the regulation of human beta defensin 1 (hBD1) and human beta defensin 3 (hBD3) following exposure to C. albicans SC5314 and clinical isolates from patients with AVVC and RVVC that had been previously characterized. To explore whether BD1h and BD3h expression could be modulated by different ligands, various innate immune receptor agonists were tested, including those for TLR4, TLR1/2, TLR3, TLR9, Dectin-1, and heat-inactivated C. albicans. Finally, the candidicidal activity of recombinant hBD1 (commercial) and recombinant hBD3 produced using recombinant DNA techniques in E. coli was evaluated. The hBD3 gene was inserted into the pMAL-c5E plasmid and expressed as a fusion protein with MBP. Antifungal activity was determined by evaluating the candidicidal capacity of both defensins in culture with the fungus, followed by colony-forming unit (CFU) counting. Results: In the in vivo murine model of VVC, infection by C. albicans SC5314 induced early neutrophil recruitment, with high levels of IL-1β and low IL-17A concentrations. At the tissue level, marked adherence and invasion of C. albicans in the vaginal epithelium was observed at D2 post-infection (pi), with hyphal formation, PMN infiltration, and abscesses that intensified as the infection progressed. In EC from cervicovaginal washes, higher expression of BD1m and BD3m was detected, peaking at D2 pi and progressively decreasing in subsequent days. The early induction of constitutive mBD1 expression was dependent on NLRP3 inflammasome activation, whereas mBD3 expression was regulated by the IL-17 receptor A-dependent signaling pathway. NLRP3 KO and IL-17RA KO mice showed reduced levels of mBD1 and mBD3, respectively, with a more pronounced decrease in mBD3 levels observed in IL-17RA KO mice. This highlights the importance of these pathways in the induction of these antimicrobial peptides (AMPs) during the local immune response against C. albicans. The characterization of virulence factors and antifungal resistance in clinical isolates of C. albicans from AVVC and RVVC patients revealed differential virulence profiles and a high resistance to azoles. These findings suggest that distinct virulence strategies may be associated with different clinical forms of the infection. In in vitro models using EC, BD1h expression was significantly reduced following exposure to clinical isolates from AVVC and RVVC patients, while BD3h expression showed strain-dependent reduction. Additionally, TLR4 activation induced both BD1h and BD3h expression, whereas TLR1/2 and TLR3/TLR9 activation induced only BD3h expression. Finally, regarding the activity of recombinant peptides as potential therapeutic alternatives, rBD1h showed candidicidal activity against the SC5314 strain and a fluconazole-resistant isolate from an AVVC patient, but was not effective against an RVVC isolate. In contrast, rBD3h demonstrated candidicidal activity against C. albicans SC5314. Neither recombinant defensin showed cytotoxicity in human cells. Conclusions and contributions of this doctoral work: The findings of this study highlight the role of BDs in the innate immune response of the female genital tract and their differential regulation via IL-17RA and NLRP3 pathways. The characterization of clinical isolates suggests the existence of specific virulence strategies in vaginal isolates from AVVC and RVVC patients, which may influence infection pathogenesis and treatment. Given the observed resistance to azoles, the drugs of choice for Candida vaginitis, the antifungal activity of BD1h and BD3h suggests their potential as therapeutic alternatives in the context of rising antifungal resistance, contributing to the development of more effective strategies for managing RVVC. 2027-07-31 Fil.: Angiolini, Sofia Carla. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. 2025-08-27T14:44:31Z 2025-08-01 doctoralThesis http://hdl.handle.net/11086/557300 spa Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ |
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