Aplicación de ciencia de datos para el estudio de la activación y modulación de células microgliales y macrófagos
Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2025
| Main Author: | |
|---|---|
| Other Authors: | |
| Format: | doctoralThesis |
| Language: | spa |
| Published: |
2025
|
| Subjects: | |
| Online Access: | http://hdl.handle.net/11086/557295 |
| _version_ | 1841742281660432384 |
|---|---|
| author | Manzone Rodriguez, Clarisa |
| author2 | Iribarren, Pablo |
| author_facet | Iribarren, Pablo Manzone Rodriguez, Clarisa |
| author_sort | Manzone Rodriguez, Clarisa |
| collection | Repositorio Digital Universitario |
| description | Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2025 |
| format | doctoralThesis |
| id | rdu-unc.557295 |
| institution | Universidad Nacional de Cordoba |
| language | spa |
| publishDate | 2025 |
| record_format | dspace |
| spelling | rdu-unc.5572952025-08-27T15:16:49Z Aplicación de ciencia de datos para el estudio de la activación y modulación de células microgliales y macrófagos Manzone Rodriguez, Clarisa Iribarren, Pablo Celej, María Soledad Galiano , Mauricio Raúl Sotomayor, Claudia Elena Ramos, Alberto Javier Procesamiento automatizado de datos Biología celular Sistema nervioso Ciencia de datos Microglía Autofagia Inflamación Computadores Análisis estadístico Simulación por computador Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2025 Fil.: Manzone Rodriguez, Clarisa. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. La ciencia de datos ha ganado un lugar importante en la actualidad. Diversas áreas del conocimiento la incorporan en sus enfoques, incluyendo las ciencias básicas y de la salud. Un científico de datos es capaz de aplicar el método científico para extraer información valiosa y responder preguntas a partir del análisis de datos. La ciencia de datos es una disciplina interdisciplinaria que se sostiene sobre tres pilares fundamentales: la estadística, la matemática y la informática. En este contexto, ha emergido el concepto de científico de biodatos, quien combina las habilidades técnicas de un científico de datos con el conocimiento biológico del área en la que trabaja. Esta tesis se enmarca en un enfoque de ciencia de datos, con el objetivo de analizar, curar y aplicar técnicas machine learning (análisis supervisado y no supervisado), para extraer información biológica de conjuntos de datos publicados en bases públicas. Las preguntas que buscamos responder están relacionadas con la modulación de la respuesta inflamatoria de la microglía a través de la regulación de la autofagia. Las células microgliales son los macrófagos residentes del sistema nervioso central (SNC). En condiciones fisiológicas, contribuyen al mantenimiento de la homeostasis del tejido cerebral. Sin embargo, frente a señales de daño o infección, se activan rápidamente gracias a un amplio repertorio de receptores de membrana, entre ellos los receptores tipo Toll (TLRs). Cuando estos reconocen sus ligandos, se desencadenan complejas cascadas de señalización intracelular que conducen a la activación inflamatoria de la microglía, incluyendo la liberación de mediadores proinflamatorios. Una respuesta inflamatoria eficiente puede ser beneficiosa al eliminar el estímulo patogénico. No obstante, si la inflamación se prolonga o no se regula adecuadamente, puede resultar perjudicial para el sistema nervioso y contribuir a la muerte neuronal. Varias patologías neurodegenerativas, como el Parkinson y el Alzheimer, presentan un importante componente inflamatorio. Aunque aún no se ha determinado si la neuroinflamación precede o sigue a la neurodegeneración, sí se sabe que influye significativamente en la progresión y el pronóstico de estas enfermedades, que actualmente no tienen cura. Por este motivo, en nuestro laboratorio estudiamos mecanismos que puedan modular la respuesta neuroinflamatoria, particularmente la autofagia. Evidencias previas de nuestro grupo demostraron que la activación de TLR2 induce la autofagia. Esta respuesta es un mecanismo proteolítico que involucra el sistema de endomembranas y múltiples complejos proteicos, y cumple funciones clave como el reciclado de componentes celulares. Deficiencias en este sistema se asocian al desarrollo de diversa diversas patologías. En esta tesis, buscamos caracterizar la vinculación entre la autofagia y la respuesta inmune de la microglía, combinando estrategias de ciencia de datos con estudios in vitro para validar los hallazgos obtenidos in silico. Como primer objetivo, desarrollamos un flujo de trabajo de ciencia de datos modular e iterativo. Aunque este trabajo se optimizó para el análisis de datos de secuenciación de RNA tipo bulk, su diseño le otorga la flexibilidad necesaria para adaptarse a otros tipos de datos. Esta herramienta representa un recurso valioso que puede reutilizarse y optimizarse en futuros proyectos del laboratorio. Validamos el flujo de trabajo con un conjunto de datos de RNA-seq disponible en la base pública GEO (NIH). Con las funciones y pipelines desarrollados obtuvimos, a partir de una matriz de conteos de RNA, datos procesados de calidad, filtrados según criterios preestablecidos, y normalizados utilizando distintos métodos evaluados comparativamente. El conjunto de datos utilizado correspondía a células microgliales murinas primarias estimuladas con el ligando específico de TLR2, Pam3CSK4, lo que nos permitió, a partir de su posterior análisis, abordar nuestras preguntas biológicas. Encontramos una sobreexpresión de varios transcriptos asociados a procesos neuroinflamatorios, y nos enfocamos particularmente en Nos2, que codifica para la enzima iNOS, y Tnf, que produce la citocina proinflamatoria TNF. Validamos estos hallazgos mediante estudios in vitro con la línea celular murina BV2, estimulada con ligandos de TLR2 y TLR4, observando un incremento significativo en la liberación de óxido nítrico (NO, por sus siglas en inglés) y TNF. El análisis de enriquecimiento de rutas (KEGG) mostró una regulación positiva de la vía PI3K, proteína involucrada en los primeros pasos de la autofagia. Evaluamos in vitro el efecto de la inhibición de PI3K con LY294002 (LY; inhibidor global) y 3-metiladenina (3-MA; inhibidor específico de la clase III, asociada a la autofagia). Observamos una modulación más marcada de la liberación de mediadores inflamatorios con 3-MA, en comparación con LY. Asimismo, desarrollamos una herramienta de visualización basada en GSEA (Gene Set Enrichment Analysis), modificando su código para permitir el mapeo de genes de interés directamente sobre los gráficos de enriquecimiento. Esta modificación resultó útil para interpretar el posicionamiento y la relevancia funcional de genes individuales dentro de los conjuntos enriquecidos. Validamos la herramienta con distintos conjuntos de datos procesados mediante nuestro flujo de trabajo, observando coherencia en los resultados, en particular en genes clave de la vía autofágica, como aquellos que codifican para mTOR y TFEB, cuyos niveles de expresión resultaron consistentes con una modulación negativa de la autofagia en la microglía estimulada con Pam3. Además, confirmamos una regulación positiva de mediadores proinflamatorios en los análisis GSEA de este mismo conjunto de datos. Dado que PI3K clase III cumple un rol central en los eventos tempranos de activación de la autofagia, y que 3-MA es un inhibidor ampliamente utilizado de esta vía, decidimos estudiar la modulación funcional de la autofagia inducida por TLR2. Validamos estos hallazgos mediante estudios in vitro en células BV2 estimuladas con ligandos de TLR2, observando activación de la autofagia medida por conversión de LC3B-I a LC3B-II, la cual fue inhibida por 3-MA, confirmando la participación funcional de esta vía. Finalmente, mediante ensayos de neurotoxicidad en un modelo de cocultivo de microglía y neurona, demostramos que la activación de la microglía con ligandos de TLR2 y TLR4 induce muerte neuronal, efecto que fue regulado por la inhibición de la autofagia con 3-MA en la microglía. Estos resultados sugieren que la autofagia inducida por TLRs, contribuye a la neurotoxicidad provocada por la activación microglial. En conjunto, estos hallazgos demuestran que la integración de enfoques computacionales y experimentales permite identificar mecanismos clave en la regulación de la respuesta inflamatoria de la microglía. En particular, la modulación de la autofagia puede ser una estrategia potencial para limitar el daño neuroinflamatorio y favorecer la supervivencia neuronal. Data science has gained significant relevance in recent years, becoming increasingly integrated into diverse fields of knowledge, including the basic and health sciences. A data scientist applies the scientific method to extract valuable insights and answer questions through data analysis. This interdisciplinary field stands on three fundamental pillars: statistics, mathematics, and computer science. Within this context, the concept of a biodata scientist has emerged—someone who combines the technical skills of a data scientist with biological expertise relevant to their domain. This thesis adopts a data science approach to analyze, curate, and apply machine learning techniques (both supervised and unsupervised) to extract biological insights from publicly available datasets. We sought to address questions related to the modulation of microglial inflammatory responses through autophagy regulation. Microglial cells are the resident macrophages of the central nervous system. Under physiological conditions, they help maintain brain tissue homeostasis. However, upon detecting damage or infection, they rapidly activate via a broad repertoire of membrane receptors, including Toll-like receptors (TLRs). Recognition of ligands by these receptors triggers complex intracellular signaling cascades that lead to microglial activation and release of pro-inflammatory mediators. An efficient inflammatory response can be beneficial in eliminating pathogenic stimuli. However, if sustained or improperly regulated, it may become detrimental to the nervous system and contribute to neuronal death. Numerous neurodegenerative diseases, such as Parkinson’s and Alzheimer’s, exhibit significant inflammatory components. Although it remains unclear whether neuroinflammation precedes or follows neurodegeneration, it is known to profoundly influence the progression and prognosis of these currently incurable conditions. For this reason, our laboratory investigates mechanisms that may modulate neuroinflammatory responses, with a particular focus on autophagy. Previous evidence from our group showed that TLR2 activation induces autophagy—a proteolytic mechanism involving the endomembrane system and multiple protein complexes, with essential functions such as recycling cellular components. Impairments in this process have been associated with various diseases. This thesis aims to characterize the relationship between autophagy and the microglial immune response, combining data science strategies with in vitro validation of in silico findings. Our first objective was to develop a modular, iterative data science workflow. Although optimized for bulk RNA-seq analysis, its flexible design allows adaptation to other data types. This tool represents a valuable resource that can be reused and enhanced in future lab projects. We validated the workflow using an RNA-seq dataset from the public GEO database (NIH). From a raw RNA count matrix, the developed functions and pipelines yielded high-quality processed data, filtered according to predefined criteria and normalized using multiple methods evaluated in parallel. The dataset featured primary murine microglial cells stimulated with the TLR2-specific ligand Pam3CSK4, enabling biological interrogation aligned with our research questions. We observed overexpression of transcripts linked to neuroinflammatory processes, focusing particularly on Nos2 (encoding iNOS) and Tnf (encoding the pro-inflammatory cytokine TNF). These findings were validated in vitro using BV2 murine microglial cells stimulated with TLR2 and TLR4 ligands, showing significant increases in NO and TNF release. The KEGG pathway enrichment analysis revealed positive regulation of the PI3K pathway, a protein involved in the early steps of autophagy. We evaluated in vitro the effect of PI3K inhibition using LY294002 (LY; a broad-spectrum inhibitor) and 3-methyladenine (3-MA; a class III-specific inhibitor associated with autophagy). We observed a more pronounced modulation of inflammatory mediator release with 3-MA compared to LY. We also developed a visualization tool based on GSEA (Gene Set Enrichment Analysis), modifying its code to enable the mapping of genes of interest directly onto enrichment plots. This modification proved useful for interpreting the positioning and functional relevance of individual genes within enriched gene sets. We validated the tool using various datasets processed through our workflow, observing consistency in the results—particularly for key genes in the autophagy pathway, such as those encoding mTOR and TFEB, whose expression levels were consistent with a negative modulation of autophagy in microglia stimulated with Pam3. In addition, we confirmed positive regulation of proinflammatory mediators in the GSEA analysis of the same dataset. Since class III PI3K plays a central role in early autophagy activation and 3-MA is a widely used inhibitor of this pathway, we explored the functional modulation of autophagy induced by TLR2. In vitro assays with BV2 cells stimulated with TLR2 ligands showed autophagy activation measured by LC3B-I to LC3B-II conversion, which was suppressed by 3-MA—confirming the functional involvement of this pathway. Finally, using neurotoxicity assays in a microglia-neuron co-culture model, we showed that TLR2 and TLR4 activation of microglia induces neuronal death—an effect mitigated by autophagy inhibition with 3-MA in microglia. These results suggest that TLR-induced autophagy contributes to microglia-mediated neurotoxicity. Altogether, these findings demonstrate that integrating computational and experimental approaches enables the identification of key mechanisms regulating the microglial inflammatory response. In particular, autophagy modulation emerges as a potential strategy to limit neuroinflammatory damage and promote neuronal survival. 2027-07-31 Fil.: Manzone Rodriguez, Clarisa. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. 2025-08-27T13:55:44Z 2025-08-01 doctoralThesis http://hdl.handle.net/11086/557295 spa Attribution-NonCommercial-ShareAlike 4.0 International http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ |
| spellingShingle | Procesamiento automatizado de datos Biología celular Sistema nervioso Ciencia de datos Microglía Autofagia Inflamación Computadores Análisis estadístico Simulación por computador Manzone Rodriguez, Clarisa Aplicación de ciencia de datos para el estudio de la activación y modulación de células microgliales y macrófagos |
| title | Aplicación de ciencia de datos para el estudio de la activación y modulación de células microgliales y macrófagos |
| title_full | Aplicación de ciencia de datos para el estudio de la activación y modulación de células microgliales y macrófagos |
| title_fullStr | Aplicación de ciencia de datos para el estudio de la activación y modulación de células microgliales y macrófagos |
| title_full_unstemmed | Aplicación de ciencia de datos para el estudio de la activación y modulación de células microgliales y macrófagos |
| title_short | Aplicación de ciencia de datos para el estudio de la activación y modulación de células microgliales y macrófagos |
| title_sort | aplicacion de ciencia de datos para el estudio de la activacion y modulacion de celulas microgliales y macrofagos |
| topic | Procesamiento automatizado de datos Biología celular Sistema nervioso Ciencia de datos Microglía Autofagia Inflamación Computadores Análisis estadístico Simulación por computador |
| url | http://hdl.handle.net/11086/557295 |
| work_keys_str_mv | AT manzonerodriguezclarisa aplicaciondecienciadedatosparaelestudiodelaactivacionymodulaciondecelulasmicroglialesymacrofagos |