Funcionalización, caracterización y aplicación de nanopartículas magnéticas para la inmovilización de lectinas e hidratos de carbono en vistas a aplicaciones biotecnológicas
Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2023.
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2023
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| description | Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2023. |
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| spelling | rdu-unc.5484562023-08-30T14:24:03Z Funcionalización, caracterización y aplicación de nanopartículas magnéticas para la inmovilización de lectinas e hidratos de carbono en vistas a aplicaciones biotecnológicas Selzer, Solange M. Ferreyra, Nancy Fabiana Vico, Raquel Viviana Carrizo Garcia, María Elena Coronado, Eduardo Andrés Vericat, Carolina Consejo Fisicoquímica orgánica Nanopartículas Biotecnología Lectinas Carbohidratos Nanopartículas del metal Óxidos metálicos Nanopartículas de magnetita Espectrometría Raman Microscopia electrónica Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2023. Fil: Selzer, Solange M. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Actualmente, los nanomateriales son ampliamente utilizados para diversas aplicaciones, desde almacenamiento de energía hasta nanomedicina. Particularmente, las nanopartículas de óxido de hierro son muy prometedoras para su uso en ámbitos concernientes a la biotecnología debido, principalmente, a su biocompatibilidad. El desarrollo de diseños experimentales que permitan obtener recubrimientos adecuados, con determinadas características y funcionales a la aplicación final que se les pretende dar a las nanopartículas de óxido de hierro, puede mejorar su biocompatibilidad, disminuir su toxicidad, optimizar el direccionamiento e incorporación a una determinada célula u organela. Además, también permite modular su estabilidad coloidal en medios biológicos u otro tipo de entornos complejos. Es por ello que es de sumo interés el abordaje de la síntesis, funcionalización y caracterización de nanopartículas de óxido de hierro modificadas superficialmente, que resulten robustas y versátiles, y que además se puedan obtener de manera reproducible. En este contexto, el objetivo general de esta tesis doctoral fue diseñar, preparar y caracterizar nanopartículas de magnetita (MNPs) funcionalizadas con diferentes grupos químicos que sirvan como base para la inmovilización de la lectina Concanavalina A (ConA) o hidratos de carbono (HC) para potenciales aplicaciones biotecnológicas. El primer capítulo de este trabajo de tesis resume el estado del arte en referencia a nanomateriales y en particular sobre las propiedades de las nanopartículas de óxido de hierro y su aplicación en biotecnología y nanomedicina. El Capítulo 2 presenta los fundamentos teóricos de las técnicas de caracterización y análisis implementadas. Adicionalmente, se desarrollan aspectos referentes a procesos de optimización realizados para las medidas de microscopía Raman y espectroscopía fotoelectrónica de rayos X (XPS), el análisis de imágenes de microscopía electrónica de transmisión (TEM) y datos de difracción de rayos X (XRPD), teniendo en cuenta las particularidades de estos nanomateriales. También, se aborda la preparación y tratamiento de los electrodos de trabajo utilizados para las medidas electroquímicas. En el Capítulo 3 se discuten y comparan las metodologías empleadas para sintetizar MNPs sin modificación química superficial basadas en co-precipitación alcalina utilizando NaOH o NH4OH como reguladores de pH para lograr la precipitación de magnetita. Se analizan exhaustivamente las características estructurales y morfológicas de las nanopartículas obtenidas. En el Capítulo 4 se aborda la funcionalización química de las MNPs con sales de diazonio, derivadas de aminas aromáticas conteniendo grupos carboxílicos (4-aminobenzoico) o aminos (m-fenilendiamina). Se analizan las características de las nanopartículas obtenidas y el cubrimiento superficial logrado empleando diferentes condiciones experimentales para la funcionalización por metodologías in situ y ex situ. Adicionalmente, se comparan las características de las MNPs funcionalizadas con sales de diazonio que exponen grupos amino con las obtenidas mediante una metodología, ampliamente desarrollada en bibliografía, como la silanización, utilizando 3-aminopropiltrietoxisilano (APTES). En el Capítulo 5 se discuten los resultados obtenidos en referencia a estudios de citotoxicidad, internalización celular y estabilidad coloidal en diferentes medios de cultivo de las MNPs no modificadas y de las funcionalizadas con grupos carboxílicos o aminos. En estos estudios se abordó el análisis del diámetro hidrodinámico y la carga superficial. Además, se evaluó la internalización celular y la activación del proceso de degradación intracelular, mediante microscopía confocal de fluorescencia, y analizando la fusión de la imágenes obtenidas por microscopía de contraste de interferencia diferencial y de reflexión. En el Capítulo 6 se presentan los resultados sobre la funcionalización superficial de las MNPs con grupos alquino terminales y la caracterización de las nanopartículas obtenidas. Esta funcionalización se realizó mediante unión directa del carboxilato del ácido 10-undecinoico (AU) a la superficie de magnetita y alternativamente, como contraposición, por unión covalente mediante la formación de enlaces amida, sobre las MNPs que exponen grupos amino. Se analizan, comparan y discuten críticamente los porcentajes de funcionalización obtenidos, se evalúa la estabilidad de la funcionalización lograda y en el caso del método de unión directa, se correlaciona la misma con la naturaleza de los enlaces formados. La eficiencia de la unión covalente del AU a los grupos amino expuestos en la superficie también fue analizada en forma comparativa partiendo de MNPs funcionalizadas con sales de diazonio derivadas de m-fenilendiamina y APTES. En el Capítulo 7 se evaluaron y compararon dos metodologías de conjugación con hidratos de carbono (HC) utilizando como material de partida las MNPs funcionalizadas covalentemente con grupos amino o alquinos terminales. Los HC empleados fueron los derivados de azida β-D-Glucosa, β-D-Galactosa y α-D-Manosa, todas peracetiladas. Una de las metodologías utilizadas se basó en las reacciones Click alquino-azida catalizada por Cu(I) usando solvente orgánico y como alternativa se diseñó y llevó a cabo un método original tipo one pot en medio acuoso. Estas metodologías fueron comparadas empleando dos métricas de Química Verde y se concluyó que, respecto a la metodología convencional, la alternativa innovadora aquí propuesta presenta reducción en la toxicidad de reactivos y solventes, menor costo, mayor seguridad y simplificación operativa, lo que le otorga mayor sustentabilidad y posible escalabilidad para el proceso de síntesis. En el Capítulo 8 se abordan las aplicaciones de las MNPs funcionalizadas con grupos carboxílicos, en estudios de interacción lectina-glicano. Las MNPs con grupos carboxílicos fueron utilizadas para la modificación superficial de electrodos de carbono vítreo para la subsiguiente inmovilización de la lectina Concanavalina A (ConA) y el análisis de su interacción con la glicoproteína Glucosa Oxidasa (GOx). Dicha interacción se estudió empleando técnicas electroquímicas y también mediante análisis en tiempo real por resonancia de plasmón superficial. Teniendo en cuenta la posible aplicación de este nanomaterial en sistemas o entornos con altas concentraciones de proteínas, se analizan y discuten los efectos de la albumina sérica bovina (BSA) en la interacción entre Con A y GOx. Por último, en este capítulo también se presentan estudios iniciales referentes al diseño de plataformas de biorreconocimiento con detección electroquímica inmovilizando Con A sobre electrodos de oro y analizando la respuesta frente a las MNP conjugadas con α-D-Manosa y β-D-Galactosa. A modo de cierre y para realizar un análisis global de los resultados y logros obtenidos durante este trabajo, el Capítulo 9 presenta las conclusiones generales de la tesis doctoral. Currently, nanomaterials are widely used for a variety of applications, from energy storage to nanomedicine. Particularly, iron oxide nanoparticles are very promising for use in areas concerning biotechnology mainly due to their biocompatibility. The development of experimental designs to obtain suitable coatings, with certain characteristics and functional to the final application of the iron oxide nanoparticles, can improve their biocompatibility, decrease their toxicity, optimize targeting and incorporation into a given cell or organelle, and/or provide them with colloidal stability in biological media or other complex environments. It is therefore of great interest to address the synthesis, functionalization, and characterization of functionalized iron oxide nanoparticles, which are robust and versatile, and which can also be obtained in a reproducible manner. In this context, the overall objective of this doctoral thesis was to design, prepare and characterize magnetite nanoparticles (MNPs) functionalized with different chemical groups that serve as a basis for the immobilization of the lectin Concanavalin A (ConA) or carbohydrates (CH) for potential biotechnological applications. The first chapter of this thesis summarizes the state of the art in reference to nanomaterials and in particular the properties of iron oxide nanoparticles and their application in biotechnology and nanomedicine. The theoretical bases of applied characterization and analysis techniques are described in Chapter 2. In addition, aspects concerning optimization processes performed for Raman microscopy and X-ray photoelectron spectroscopy (XPS) measurements, transmission electron microscopy (TEM) image analysis and X-ray powder diffraction data (XRPD) are developed, considering the particularities of these nanomaterials. The preparation and treatment of the working electrodes used for electrochemical measurements is also addressed. The methodologies used to synthesize MNPs without surface chemical modification from alkaline co-precipitation using NaOH or NH4OH as pH regulators to achieve magnetite precipitation are discussed and compared in Chapter 3. The structural and morphological characteristics of the nanoparticles obtained are thoroughly analyzed. The chemical functionalization of NPs using diazonium salts from aromatic amines containing carboxylic (4-aminobenzoic) or amino (m-phenylenediamine) groups is addressed in Chapter 4. The characteristics of the nanoparticles and the surface coverage achieved using different experimental conditions for functionalization by in situ and ex situ methodologies, are analyzed. Additionally, the characteristics of MNPs functionalized with diazonium salts exposing amino groups are compared with those obtained by a methodology, widely developed in the literature as silanization, using 3-aminopropyltriethoxysilane (APTES). The results obtained from cytotoxicity studies, cellular internalization, and colloidal stability of unmodified MNPs and those functionalized with carboxylic or amino groups in different environments are discussed in Chapter 5. These studies addressed the analysis of hydrodynamic diameter, surface charge and evaluated cell internalization and activation of the intracellular degradation process, by imaging by fluorescence confocal microscopy, and by analyzing the merge of the images obtained by differential interference contrast and reflection microscopy. The results of the surface functionalization of NPMs with terminal alkyne groups and the characterization of the nanoparticles obtained are presented in Chapter 6. This functionalization was performed by direct attachment of the carboxylate of 10-undecenoic acid (AU) to the magnetite surface and alternatively, as a counterpart, by covalent attachment through the formation of amide bonds, on the MNPs exposing amino groups. The functionalization percentages obtained are analyzed, compared, and critically discussed, the stability of the functionalization achieved is evaluated and, in the case of the direct bonding method, correlated with the nature of the bonds formed. The efficiency of AU covalent binding to surface exposed amino groups was also comparatively analyzed starting from MNPs functionalized with diazonium salts derived from m-phenylenediamine and APTES. In Chapter 7, two carbohydrate (CH) conjugation methodologies were evaluated and compared using MNPs covalently functionalized with amino or terminal alkyne groups as starting material. The CH employed were the azide derivatives β-D-Glucose, β-D-Galactose, and α-D-Mannose, all per-acetylated. One of the methodologies used was based on Cu(I)-catalyzed Click alkyne-azide reactions using organic solvent and as an alternative an original one pot method was designed and carried out in aqueous medium. These methodologies were compared using two Green Chemistry metrics and it was concluded that, with respect to the conventional methodology, the innovative alternative proposed here presents a reduction in the toxicity of reagents and solvents, lower cost, greater safety, and operational simplification, which gives it greater sustainability and possible scalability for the synthesis process. The applications of MNPs functionalized with carboxylic groups in lectin-glycan interaction studies are discussed in Chapter 8. MNPs with carboxylic groups were used for surface modification of glassy carbon electrodes for subsequent immobilization of the lectin ConA and analysis of its interaction with the glycoprotein Glucose Oxidase (GOx). This interaction was studied using electrochemical techniques and by real-time analysis by surface plasmon resonance. Considering the possible application of this nanomaterial in systems or environments with high protein concentrations, the effects of bovine serum albumin.(BSA) on the interaction between ConA and GOx are analyzed and discussed. Finally, this chapter also presents initial studies concerning the design of biosensing platforms with electrochemical sensing immobilizing ConA on gold electrodes and analyzing the response against MNPs conjugated with α-D-Mannose and β-D-Galactose. In closing, and to make a global analysis of the results and achievements obtained during this work, the general conclusions of the doctoral thesis are presented in Chapter 9. 2025-07-31 Fil: Selzer, Solange M. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. 2023-08-15T12:27:03Z 2023-08-01 doctoralThesis http://hdl.handle.net/11086/548456 spa Atribución-NoComercial-CompartirIgual 4.0 Internacional http://creativecommons.org/licenses/by-nc-sa/4.0/ |
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