Rol de la proteína específica de Leucocitos 1 (LSP1) en funcionalidad de las células dendríticas como disparadoras de una respuesta inmune antitumoral
Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2022
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2022
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| description | Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2022 |
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| spelling | rdu-unc.298852022-12-03T05:04:26Z Rol de la proteína específica de Leucocitos 1 (LSP1) en funcionalidad de las células dendríticas como disparadoras de una respuesta inmune antitumoral Pascual, María Mercedes Morón, Víctor Gabriel Bisig, C. Gastón Calfa, Gastón Diego Maccioni, Mariana Toscano, Marta Alicia Sistema inmunológico Células dendríticas Linfocitos Animales de laboratorio Métodos de laboratorio Antígenos Péptidos Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2022 Fil: Pascual, María Mercedes. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. La proteína específica de leucocitos 1, LSP1, es una fosfoproteína intracitoplasmática de 52 kDa que se une a F-actina y es expresada en todos los leucocitos humanos y murinos, como así también en células endoteliales. Múltiples estudios indican que polimorfismos o disminuciones en los niveles de expresión de LSP1 constituyen factores de riesgo para el desarrollo de distintos tipos de cáncer, como cáncer de mama y hepatocarcinoma. A pesar de su bajo número tanto en tumores como en órganos linfoides, las células dendríticas son esenciales para la inducción de la respuesta inmune antitumoral. Las células dendríticas capturan antígenos asociados a tumor, los procesan transformándolos en péptidos inmunogénicos que son cargados en las moléculas del MHC, y los presentan a los linfocitos T proveyendo además coestimulación y citoquinas, permitiendo de esta manera la generación de linfocitos T citotóxicos, células fundamentales en la inmunidad antitumoral. Estudios previos llevados a cabo por nuestro grupo de investigación revelaron que la ausencia de LSP1 en células dendríticas, afecta la inducción de una respuesta citotóxica in vivo en animales WT y la activación de linfocitos T CD8+ vírgenes in vitro. Además, las células dendríticas LSP1 KO exponen menor proporción de péptidos antigénicos asociados a MHC-I en su superficie debido a un defecto en la traslocación del antígeno desde los endosomas al citosol, proceso fundamental para una eficiente presentación cruzada de antígenos. Para determinar el rol de LSP1 en la generación de una respuesta inmune antitumoral utilizamos la línea de melanoma murino B16-OVA. Observamos que luego de implantar de manera subcutánea 1.105 células, ratones carentes de LSP1 desarrollan tumores de manera más temprana, los mismos crecen a una velocidad superior y alcanzan tamaños mayores que los respectivos tumores implantados en animales WT. Dichos tumores presentan una menor área de necrosis, fenómeno que se ve acompañado de un menor infiltrado por parte de las células del sistema inmune. Sin embargo, la composición del infiltrado inflamatorio es similar en ambos grupos de animales, siendo las células dendríticas CD103+ la población minoritaria en tumores extraídos tanto de ratones WT como de ratones LSP1 KO. La ausencia de LSP1 a nivel leucocitario condiciona su capacidad para acceder al microambiente tumoral, lo que podría explicar, al menos en parte, la menor frecuencia leucocitaria hallada en tumores extraídos de ratones carentes de LSP1. Por otro lado, el análisis del microambiente tumoral reveló que los tumores que se desarrollan en ratones LSP1 KO presentan una mayor concentración de múltiples citoquinas inflamatorias, incluyendo IL-23, TNF-α, IL-12p70, IL-1β, IL-10, IL-27, IL-17A, IFN-β, y GM-CSF, que presentes en altas concentraciones de manera crónica pueden favorecer el desarrollo del tumor. La caracterización de las poblaciones leucocitarias en ganglio linfático indicó que no existen diferencias a nivel basal entre los animales WT y LSP1 KO. Sin embargo, el análisis de los ganglios drenantes de tumor muestra varias diferencias al comparar los grupos experimentales. En ratones LSP1 KO, los ganglios drenantes de tumor presentan una menor frecuencia de neutrófilos y linfocitos B, sumado a una mayor proporción de monocitos y linfocitos T. Además, existe una mayor frecuencia de células dendríticas totales, pero de mayor relevancia para el desarrollo de una respuesta inmune antitumoral es la remodelación que existe en este compartimento celular, ya que hay una menor frecuencia de células dendríticas CD103+ y CD8α+ capaces de efectuar la presentación cruzada de antígenos. La funcionalidad de las células dendríticas también se ve comprometida por la ausencia de LSP1. Las mismas, capturan antígenos tumorales de manera deficiente y consecuentemente, las células dendríticas CD103+, principales responsables de transportar antígenos al ganglio drenante de tumor, lo hacen en una menor proporción, lo cual no se encuentra condicionado por los niveles de expresión de CCR7. Además, las células dendríticas LSP1 KO presentes en ganglio drenante a tumor inducen una menor activación y proliferación de linfocitos T CD8+, afectando la generación de la respuesta inmune antitumoral. Dichas células dendríticas, expresan mayores niveles de la molécula inhibitoria PD-L1, sin embargo, esta vía de señalización no es la principal responsable del deficiente control tumoral observado en los ratones LSP1 KO ya que el bloqueo de la interacción PD-L1/PD-1 mediante la utilización de un anticuerpo monoclonal dirigido contra PD-1 no modifica el tamaño tumoral en estos animales. La evaluación de linfocitos T específicos en sangre periférica indica que los niveles son comparables entre ratones WT y LSP1 KO. Lamentablemente, dichas células no pudieron ser halladas a nivel tumoral ni el ganglio drenante, posiblemente por su bajo número y por problemas de sensibilidad y especificidad de la técnica. Sin embargo, la producción de moléculas efectoras como perforinas y granzima B, como así también la producción simultánea de IFN-γ y el marcador de degranulación Lamp1, es significativamente menor en linfocitos T CD8+ intratumorales en ratones LSP1 KO, lo que indica que dichos linfocitos poseen alteraciones a nivel funcional. Al evaluar la capacidad citotóxica in vivo en ratones con tumor no se detectó lisis específica en ninguno de los dos grupos de animales estudiados. Por ello, con el objetivo de potenciar la respuesta inmune, los animales fueron inmunizados con OVA/CpG-ODN/Coa-ASC16, lo cual evidenció un menor porcentaje de lisis en los ratones LSP1 KO, reflejando su menor capacidad citotóxica a pesar del fuerte estímulo brindado para desarrollar este tipo de respuesta. Finalmente, los resultados indican que una única inmunización con OVA/CpG-ODN/Coa-ASC16 protege parcialmente a los ratones tanto WT como LSP1 KO frente al desarrollo tumoral e incrementa su sobrevida. Sin embargo, la respuesta generada en los animales LSP1 KO continúa siendo inferior a la que se desencadena en los animales WT, lo que indica que la menor citotoxicidad desarrollada en los animales LSP1 KO condiciona su respuesta frente a tumores e impide un adecuado control de los mismos. A partir de los resultados obtenidos podemos concluir que la ausencia de LSP1 afecta la generación de la respuesta inmune antitumoral en varios niveles. Los leucocitos presentan limitaciones en su capacidad migratoria o de extravasación lo que dificulta su acceso al microambiente tumoral y genera la menor proporción de infiltrado observado en los animales LSP1 KO, limitando de esta manera la eliminación de las células transformadas. Además, se afecta tanto la captura de antígenos tumorales por parte de las células dendríticas como su transporte al ganglio drenante a tumor, sitio donde se inicia la respuesta inmune específica. Así, sumado a los defectos en la traslocación antigénica previamente observados en nuestro grupo, las DCs presentan dificultades para activar e inducir la proliferación de linfocitos T CD8+ vírgenes, células fundamentales en la eliminación de tumores. Adicionalmente los linfocitos T CD8+ generados poseen una alteración en su funcionalidad, lo cual reduce su capacidad citotóxica y limita aún más el control del tumor. La falta de control del desarrollo tumoral podría ser responsable de la generación de un microambiente inflamatorio que se sostiene de manera crónica a nivel intratumoral, lo que favorecería a un mayor desbalance en la respuesta inmune, dificultando aún más el control del desarrollo tumoral. Por lo tanto, podemos concluir que el mayor tamaño tumoral observado en animales LSP1 KO es el resultado de múltiples factores que condicionan el desarrollo de la respuesta inmune antitumoral, con las células dendríticas como un claro factor central. LSP1 is an intracellular phosphoprotein expressed in leukocytes and endothelial cells from humans and mice. LSP1 polymorphisms or reduced expression are risk factors for some cancer types. We demonstrated that B16-OVA tumors implanted in LSP1 KO mice reach bigger sizes and grow faster than tumors inoculated in WT mice. Our results indicate that LSP1 lack modifies antitumor immune response. Leukocytes have a reduced extravasation ability, resulting in a diminished access to the tumor microenvironment and in a lower frequency of total leukocytes in tumors harvested from LSP1 KO mice. Dendritic cells antigen capture and draining lymph node migration is also influenced by LSP1 absence. In addition, LSP1 KO dendritic cells cannot activate and induce CD8+ T cells proliferation in an appropriate way. CD8+ T cells functionality is affected too. CD8+ lymphocytes have a reduced cytotoxic activity demonstrated by perforin, granzyme B and IFN-γ lower production, contributing to the deficient control of tumor growth. The uncontrolled tumor development observed in LSP1 KO mice contributes to a chronic proinflammatory microenvironment generation, favoring the unbalanced immune response and hindering the tumor growth control. Therefore, we conclude that the bigger tumor size observed in LSP1 KO mice is the result of multiple factors that influence the development of antitumor immune response, having dendritic cells a key role. 2024-09-30 Fil: Pascual, María Mercedes. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. 2022-12-02T17:44:41Z 2022-10-01 doctoralThesis http://hdl.handle.net/11086/29885 spa Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ |
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