Glicosilación de tipo 0-GalNAc en el núcleo de células humanas
Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017
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2020
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| author | Cejas, Romina B. |
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| description | Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017 |
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| institution | Universidad Nacional de Cordoba |
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| publishDate | 2020 |
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| spelling | rdu-unc.153692023-08-30T14:25:52Z Glicosilación de tipo 0-GalNAc en el núcleo de células humanas Cejas, Romina B. Irazoqui, Fernando José Nicotra, Viviana Estela Alvarez, María Elena Cabanillas, Ana María de Los Angeles D´Alessio, Cecilia Glicosilación Celulas eucarioticas Proteínas Glicoproteinas Enzimas Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2017 Cejas, Romina B. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Irazoqui, Fernando José. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Nicotra, Viviana Estela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Orgánica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina. Alvarez, María Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Cabanillas, Ana María de Los Angeles. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. D´Alessio, Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina. El núcleo es una organela altamente compleja y es considerado una de las estructuras más importantes de las células eucariotas. Su complejidad es un reflejo de dos funciones esenciales que cumple en la célula: una de ellas es la organización y replicación del genoma mientras que la otra es la distribución y regulación de la información genética. Diversas proteínas sufren modificaciones postraduccionales en el núcleo, modulando directa o indirectamente la expresión génica y la función celular. Entre algunas de las modificaciones que ocurren en las proteínas nucleares de mamíferos podemos mencionar la acetilación, la metilación, la fosforilación, la ubiquitinación y la glicosilación. La glicosilación es la modificación postraduccional (MPT) más frecuentemente encontrada en las proteínas. Luego de la N-glicosilación, la glicosilación tipo O-N-acetilgalactosamina (O-GalNAc glicosilación) de proteínas es el tipo principal de glicosilación en Eucariotas superiores. La biosíntesis de glicanos de tipo O-GalNAc es un proceso complejo que típicamente comienza en Golgi. La familia de isoenzimas polipeptidil-GalNAc-Transferasas (ppGalNAc-T de 1 a la 20) catalizan la transferencia de GalNAc, aportado por el azúcar nucleótido UDP-GalNAc, a los residuos de serina (Ser) y treonina (Thr) en las proteínas sustrato, iniciando la glicosilación de tipo O-GalNAc. Luego diferentes glicosil transferasas extienden estos glicanos dando como resultado diversos tipos de glicoproteínas complejas. El presente trabajo de tesis doctoral está centrado en el estudio de la glicosilación de tipo O-GalNAc en el núcleo celular. Con este objetivo, el enfoque de este trabajo fue la descripción de la localización nuclear de todos los actores necesarios para el inicio de la biosíntesis de glicanos de tipo O-GalNAc: la enzima ppGalNAc-transferasa, el sustrato donante de azúcar UDP-GalNAc, la demostración de la actividad nuclear GalNAc-transferasa y la identificación de las proteínas O-GalNAc glicosiladas como los productos de biosíntesis nuclear. Para ello, se utilizaron líneas celulares humanas crecidas en cultivo, a las cuales se les extrajo el núcleo mediante fraccionamiento sub-celular. En particular se estudió la distribución de la enzima ppGalNAc-T3 mediante microscopía confocal y ensayos de western blot en las diferentes fracciones subcelulares. Además, a partir de los núcleos purificados se comprobó la disponibilidad de UDP-GalNAc en esta organela, la cual puede aumentarse suplementado con un exceso de UDP-GalNAc a los núcleos purificados. Este UDP-GalNAc en exceso es capaz de atravesar la membrana nuclear hacia el interior nuclear y, si estos núcleos son incubados a 37 °C, es posible apreciar la actividad GalNAc-Transferasa nuclear que aumenta en respuesta a la mayor disponibilidad de sustrato. Estos núcleos intactos sobreglicosilados mostraron actividad GalNAc-Transferasa en el interior nuclear, que fue estudiada mediante microscopía confocal y western blot. El nucleoplasma purificado demostró también una importante actividad de ppGalNAc-T. Finalmente las proteínas O-GalNAc glicosiladas en núcleo, purificadas por cromatografía de afinidad, fueron identificadas mediante espectrometría de masa. También se verificó la glicosilación de tipo O-GalNAc sobre una de las proteínas identificadas por el ensayo espectrometría de masa, mediante estudios de co-localización y FRET. Si bien es conocido que otros tipos de glicosilación, como la de tipo O-N-acetilglucosamina (O-GlcNAc glicosilación), ocurre en núcleo; este es el primer reporte de que la biosíntesis de glicanos de tipo O-GalNAc también puede iniciarse en el núcleo celular. En base a este novedoso hallazgo y a la relevancia funcional de las proteínas identificadas que pueden sufrir esta MPT en núcleo, se postula que la glicosilación de tipo O-GalNAc podría cumplir roles claves regulando la homeostasis nuclear. Cejas, Romina B. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Irazoqui, Fernando José. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Nicotra, Viviana Estela. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Orgánica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina. Alvarez, María Elena. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Cabanillas, Ana María de Los Angeles. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. D´Alessio, Cecilia. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Buenos Aires; Argentina. 2020-06-14T20:57:24Z 2020-06-14T20:57:24Z 2017 doctoralThesis http://hdl.handle.net/11086/15369 spa Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ |
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