Identificación y validación de inductores de letalidad sintética en células tumorales deficientes en recombinación homóloga

Identificación y validación de inductores de letalidad sintética en células tumorales deficientes en recombinación homóloga

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Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020

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Main Author: Villafañez, Florencia
Other Authors: Soria, Gastón
Format: doctoralThesis
Language:spa
Published: 2020
Online Access:http://hdl.handle.net/11086/15190
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author Villafañez, Florencia
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spelling rdu-unc.151902020-06-01T23:18:02Z Identificación y validación de inductores de letalidad sintética en células tumorales deficientes en recombinación homóloga Villafañez, Florencia Soria, Gastón Agnese, Alicia Mariel Argaraña, Carlos Enrique Bocco, José Luis Muñoz, Manuel Javier Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020 Villafañez, Florencia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Soria, Gastón. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Agnese, Alicia Mariel. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Ciencias Farmacéuticas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina. Argaraña, Carlos Enrique. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Bocco, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Muñoz, Manuel Javier. Universidad Nacional de Buenos Aires. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina. La Síntesis por Translesión (TLS) y la Recombinación Homóloga (HR) cooperan durante la fase S para garantizar la integridad de la horquilla de replicación. En consecuencia, la inhibición de TLS es una estrategia prometedora para la intervención terapéutica de tumores deficientes en HR dónde la inhibición de TLS promueva la inducción de letalidad sintética (LS). La principal limitación para evaluar esta hipótesis es la falta de inhibidores farmacológicos selectivos para TLS. En este trabajo de tesis se desarrolló una plataforma de cribado de Western-Blot miniaturizado para identificar inhibidores de la mono-ubiquitinación de la proteína PCNA (Antígeno nuclear de células en proliferación), una modificación pos-traduccional clave y necesaria para la activación eficiente de TLS. Luego del cribado de una biblioteca de 627 inhibidores de quinasas, se observó que la inhibición de la quinasa de sobrevida AKT dispara un profundo bloqueo de la ubiquitinación de PCNA. Mecanísticamente, se comprobó que la regulación de AKT sobre la ubiquitinación de PCNA luego de irradiación UV requiere de la actividad río arriba de la PI3-quinasa (PI3K), sin afectar los niveles basales de la ubiquitinación de PCNA en células sin perturbar. Además, se confirmó que la persistencia de la inhibición de AKT bloquea el reclutamiento de las polimerasas de TLS a los sitios de daño de ADN y afecta la procesividad de las horquillas de replicación luego de la irradiación UV, resultando en un aumento del estrés replicativo y el posterior disparo del programa de muerte celular. Notablemente, cuando se comparó la diferencia de sobrevida de células HR-proficientes versus HR-deficientes luego de irradiación UV en combinación con inhibidores de AKT, se observó inducción de LS de manera robusta en la población celular HR-deficiente. Este fenotipo se asocia a la habilidad de AKT de inhibir la Tesis de doctorado ubiquitinación de PCNA, pues la disminución dirigida de los niveles de RAD18, E3 ubiquitina ligasa de PCNA, recapitula la inducción de LS observada. Además, mediante un modelo no ubiquitinable de PCNA en el que la lisina 164 (sitio de la mono-ubiquitinación de PCNA) fue mutada por una arginina se observó inducción de LS. Además, se desarrolló en colaboración con el grupo de investigación del Dr. Marcos Villareal y el Dr. Rodrigo Quiroga del Departamento de Matemática de la Facultad de Ciencias Químicas, UNC, una nueva metodología de cribado basada en docking molecular donde se identificó un compuesto capaz de unirse al sitio de interacción de ubiquitina con PCNA y que fue validado en primera instancia en modelos celulares. Aunque todavía no se han realizado ensayos experimentales que garanticen que la inhibición de la mono-ubiquitinación de PCNA por este compuesto no se debe a efectos de tipo indirecto u “off-target” del mismo, esta aproximación preliminar demuestra la capacidad del algoritmo desarrollado para identificar inhibidores de la ubiquitinación de PCNA. Conjuntamente, este trabajo de tesis identifica a AKT como un nuevo regulador de la mono-ubiquitinación de PCNA y proporciona la prueba de concepto de que inhibir TLS es una estrategia terapéutica para eliminar selectivamente las células HR-deficientes sometidas a estrés replicativo. Adicionalmente, mediante la utilización de una estrategia de docking molecular se identificaron inhibidores de la mono-ubiquitinación de PCNA, no descriptos previamente, y que abren nuevas posibilidades al desarrollo de terapias basadas en la inhibición eficiente y selectiva de la ubiquitinación de PCNA. 2023-06-30 Villafañez, Florencia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Soria, Gastón. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Agnese, Alicia Mariel. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Ciencias Farmacéuticas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto Multidisciplinario de Biología Vegetal; Argentina. Argaraña, Carlos Enrique. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Bocco, José Luis. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Muñoz, Manuel Javier. Universidad Nacional de Buenos Aires. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Fisiología, Biología Molecular y Neurociencias; Argentina. 2020-05-19T20:00:09Z 2020-05-01 doctoralThesis http://hdl.handle.net/11086/15190 spa Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/
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