Estudios sobre el efecto de hipoxia en enfermedades neovasculares y neurodegenerativas retinales : mecanismos de autofagia y su reacción con la muerte neuronal
Tesis (Dra. En Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020.
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2020
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| author | Subirada Caldarone, Paula Virginia |
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| collection | Repositorio Digital Universitario |
| description | Tesis (Dra. En Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020. |
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| institution | Universidad Nacional de Cordoba |
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| publishDate | 2020 |
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| spelling | rdu-unc.151332020-06-02T01:54:17Z Estudios sobre el efecto de hipoxia en enfermedades neovasculares y neurodegenerativas retinales : mecanismos de autofagia y su reacción con la muerte neuronal Subirada Caldarone, Paula Virginia Sánchez, María Cecilia Contin, María Ana Iribarren, Pablo Kaiser, Claudio Federico Rotstein, Nora Patricia Retina Neuropatía Óptica Isquémica Enfermedades de los ojos Autofagia Cloroquina Hipoxia de la célula Diabetes mellitus Modelos animales Enfermedades neurodegenerativas Tesis (Dra. En Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2020. Subirada Caldarone, Paula Virginia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Sánchez, María Cecilia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Contin, María Ana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Iribarren, Pablo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Kaiser, Claudio Federico. Universidad Nacional de Cuyo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Histología y Embriología; Argentina. Rotstein, Nora Patricia. Universidad Nacional del Sur. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blanca; Argentina. Es sabido que uno de los principales insultos causante de las retinopatías proliferativas es la hipoxia, la cual es capaz de inducir neovascularización (NV) y neurodegeneración. Para mantener la homeostasis las neuronas requieren eficientes sistemas de degradación y reciclado, como la autofagia. Esta vía constituye un mecanismo de supervivencia que incrementa su flujo ante diversos estresores, aunque también puede participar en la muerte de células retinales. En este trabajo, analizamos el rol de la autofagia en tres puntos claves del modelo murino de retinopatía inducida por oxígeno (OIR) y determinamos si su modulación puede mejorar las alteraciones vasculares y no vasculares retinales. Como herramienta para determinar el flujo autofágico, los experimentos fueron llevados a cabo con cloroquina (CQ), lo cual permitió monitorear la acumulación de autofagosomas, en el tiempo, por bloqueo lisosomal. Nuestros experimentos mostraron que retinas murinas OIR extraídas en el día posnatal (P) 17 presentaron un incremento significativo en el flujo autofágico. En particular, se observó una intensa marca de LC3B y p62 en las capas internas de la retina, principalmente en células endoteliales (CEs). Con el objetivo de develar cómo el proceso autofágico participa en las distintas etapas del modelo OIR, nos propusimos inhibir la vía autofágica mediante una inyección intraocular de 3 metiladenina (3MA) a dos tiempos característicos: P12 (coincidente con la salida de la cámara de hiperoxia) y P17 (punto máximo de NV). Nuestros resultados mostraron que 3MA logró reducir los niveles de LC3B II luego de 24 horas de la inyección intraocular. Interesantemente, la inyección de 3MA en P12 incrementó la gliosis y el número de células TUNEL positivas y tendió a disminuir la funcionalidad retinal a P17. Resultados similares se obtuvieron a P26 OIR en aquellos ratones que recibieron la inyección de 3MA en P12. En referencia a las alteraciones vasculares, el tratamiento con 3MA en P12 redujo el área avascular y neovascular significativamente. En contraposición, la administración de 3MA en P17 no afectó ninguno de los parámetros anteriormente determinados, evidenciando que el bloqueo de la autofagia en etapas más tardías no afecta significativamente a la retina neural. Los efectos a nivel vascular, glial y neuronal de disrupción del flujo autofágico fueron corroborados con Spautin-1, un inhibidor específico de la vía. Una única dosis de Spautin-1 administrada a P12 logró disminuir significativamente la expresión proteica de LC3B II, restableciendose a los niveles del control OIR a P17. Además, el tratamiento no logró atenuar la gliosis ni las alteraciones funcionales. En línea con estos resultados, el ensayo de TUNEL evidenció un ligero incremento en el número de células positivas en la capa de células fotorreceptoras (ONL) a P17 OIR. Posteriormente, evaluamos si la inducción del flujo autofágico producía cambios en el modelo de OIR. Luego de una única inyección intraocular de Rapamicina a P12 OIR, se observó una disminución significativa en el área neovascular retinal, así como una menor expresión proteica del factor de crecimiento endotelial vascular (VEGF) a P17. Adicionalmente, el tratamiento con Rapamicina disminuyó la expresión de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP) a P26 OIR, sin embargo, las alteraciones funcionales persistieron. Empleando un esquema terapéutico similar, analizamos el efecto de la terapia anti-VEGF sobre el flujo autofágico. Al igual que Rapamicina, el tratamiento con inhibidor de VEGF no solo disminuyó el número de ovillos neovasculares, sino que también activó el flujo autofágico a P17 OIR, principalmente en la capa de células ganglionares (GCL) y la capa nuclear interna (INL). En conjunto nuestros resultados demuestran que todos los tratamientos de inducción e inhibición del flujo autofágico fueron capaces de reducir el área neovascular pero no lograron revertir el daño neuronal. Asimismo, comparado con los actuales tratamientos oftalmológicos, Rapamicina constituye una estrategia terapéutica más prometedora ya que reduce tanto la NV como el estrés glial persistente. En función de los cambios vasculares y neuro-gliales observados en el modelo murino de OIR, decidimos indagar si las células gliales de Müller (CGM) participan regulando dichos eventos. Para ello se realizaron ensayos in vitro exponiendo las células de la línea humana inmortalizada MIO-M1 a condiciones de normoxia, hipoxia gaseosa o hipoxia química (con Cloruro de Cobalto). Confirmamos por Western blot e inmunofluorescencia un incremento en el flujo autofágico a 4 horas de estímulo con hipoxia gaseosa, observándose el restablecimiento de los niveles de LC3B II y p62 hasta niveles controles a tiempos más prolongados (24 horas). Por otra parte, se observaron niveles elevados de LC3B II a 4 y 24 horas en presencia de hipoxia química inducida por Cloruro de Cobalto. En nuestro sistema celular, la hipoxia gaseosa incrementó los niveles proteicos de la proteína ácida fibrilar glial (GFAP), sin modificar los niveles de la enzima glutamina sintetasa (GS) y vimentina. Análogamente a lo observado en el modelo animal, Rapamicina (y en menor medida otro inductor autofágico, Resveratrol) disminuyeron la expresión proteica de GFAP. La participación de las CGM en eventos proliferativos vasculares fue evaluada incubando CEs con sobrenadantes de MIO-M1 expuestos a normoxia o hipoxia y en presencia o ausencia de moduladores del flujo autofágico. En ensayos de tubulogénesis observamos que los sobrenadantes hipóxicos de CGM en presencia de Rapamicina y Spautin-1 disminuyeron significativamente la formación de estructuras tubulares vasculares, en tanto que Resveratrol inhibió la tubulogénesis tanto en normoxia como en hipoxia. En suma, ambos abordajes (in vitro e in vivo) refuerzan nuestras observaciones y vislumbran potenciales agentes terapéuticos con principal efecto sobre los componentes vasculares y gliales. Más aún, estas mejoras retinales podrían ser alcanzadas mediante la modulación específica de las funciones de las CGM, previniendo efectos secundarios de las drogas sobre otras células retinales. Esperamos que nuestros aportes inspiren nuevas preguntas en este y otros campos de investigación, y se traduzcan en un progreso para el tratamiento de las retinopatías isquémicas proliferativas. 2023-05-01 Subirada Caldarone, Paula Virginia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas; Argentina. Sánchez, María Cecilia. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Contin, María Ana. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba; Argentina. Iribarren, Pablo. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología; Argentina. Kaiser, Claudio Federico. Universidad Nacional de Cuyo. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Histología y Embriología; Argentina. Rotstein, Nora Patricia. Universidad Nacional del Sur. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de Bahía Blanca; Argentina. 2020-04-21T12:41:49Z 2020-04-30 doctoralThesis http://hdl.handle.net/11086/15133 spa Attribution-NonCommercial-NoDerivatives 4.0 Internacional http://creativecommons.org/licenses/by-nc-nd/4.0/ |
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