Estudio del impacto de la expresión de CD39 en la progresión tumoral y su potencial como blanco terapéutico /

En el presente trabajo de tesis doctoral estudiamos el rol de la ectoenzima CD39 en la modulación la respuesta anti-tumoral, haciendo hincapié en el efecto sobre la población de LiT CD8+ con características de agotamiento. Para lograr un entendimiento más profundo realizamos el análisis en 3 modelos murinos de cáncer de origen histológico e inmunogenicidad diferentes. Demostramos que, la molécula PD-1 permite identificar a LiT CD8+ infiltrantes de tumor con diferentes estadios de agotamiento. En este sentido, observamos que una mayor expresión de PD-1 se correlaciona positivamente con una mayor co-expresión de receptores inhibitorios en superficie, la expresión del factor de transcripción inequívoco de agotamiento TOX, una reducida capacidad de producir citoquinas como TNF e IFN-γ y un elevado potencial citotóxico, evaluado por la expresión del marcador de degranulación CD107 y las moléculas citotóxicas perforina y granzima B. Nuestros resultados demuestran que las poblaciones de LiT CD8+ con niveles intermedios de expresión de PD-1 se corresponden con poblaciones con estadios más tempranos de agotamiento, mientras que elevados niveles de expresión de PD-1 corresponden a estadios terminales de agotamiento. Al centrarnos en el estudio del rol de CD39 en la respuesta antitumoral, encontramos que en el modelo de carcinoma de colon (MC38), la ausencia de CD39 conlleva a un mejor control de la progresión tumoral, y que dicho control está acompañado por un mayor infiltrado de leucocitos CD45+ y un mayor porcentaje de LiT CD8+ terminalmente exhaustos con gran potencial citotóxico. En el modelo de melanoma (B16F10), el cual se caracteriza por su bajo infiltrado de LiT CD8+, encontramos que la ausencia de CD39 favorece el control de la progresión tumoral. Dicho control posiblemente se deba a la contribución de otras poblaciones celulares, ya que la ausencia de la ectoenzima no incrementó el infiltrado de LiT CD8+ y al ahondar en la caracterización de dicha población, encontramos que la misma presenta un escaso porcentaje de células con fenotipo efector. Notoriamente, en el modelo de melanoma B16F10-OVA la ausencia de CD39 no favorece un mejor control de la progresión tumoral. Sin embargo, encontramos un mayor infiltrado de LiT CD8+ con fenotipo efector específicos para el antígeno OVA. Además, los tumores de animales CD39KO inyectados con la línea tumoral B16F10-OVA presentan un mayor infiltrado de LIT CD8+ pre-exhaustos. A continuación, evaluamos el impacto de tratamientos que potencian la función efectora de LiT CD8+ como es el complejo IL-2/α-IL-2 (IL-2cx) en combinación con la ausencia o la inhibición farmacológica (POM-1) de CD39. Encontramos que, la ausencia de CD39 no potenció el efecto sobre el control tumoral mediado por IL-2cx. Por otro lado, el tratamiento con POM-1 cuando el tumor es palpable, juntamente con IL-2cx, favorece el control de la progresión tumoral comparado con la monoterapia con IL-2cx o la ausencia de tratamiento. Además, conlleva un aumento de LiT CD8+ pre-exhaustos que expresan marcadores de LIT CD8+ terminalmente exhaustos como el factor de transcripción TOX y perforinas indicando un mayor potencial citotóxico. Estos resultados resaltan la importancia de considerar a CD39 como un potencial blanco terapéutico que mejore la respuesta anti-tumoral en diferentes tipos de cáncer, tanto en pacientes con tumores fríos que son considerados aquellos con peor pronóstico, como en pacientes que son pobres respondedores a las terapias convencionales. Evaluamos, además, mediante la estimulación in-vitro de LiT CD8+ naive, la participación de señales presentes en el MAT en la inducción de CD39 y otras características de agotamiento sobre dicha población. Nuestros resultados revelan que la estimulación a través del TCR es necesaria para la inducción de CD39 y que la presencia de citoquinas tales como IL-6 e IL-27 en conjunto con la señalización a través del TCR favorecen dicha expresión. Demostramos también que, estas señales inducen otras características de agotamiento sobre la población de LiT CD8+CD39+ como la co-expresión de receptores inhibitorios y factores de transcripción asociados a agotamiento. Sin embargo, las condiciones de estímulo utilizadas no fueron suficientes para llevar a los LiT CD8+ CD39+ a un estadio de agotamiento avanzado ya que los mismos no mostraron un compromiso en la producción de citoquinas efectoras como TNF. Finalmente, en el presente trabajo de tesis doctoral, realizamos un estudio de los diferentes estadios de agotamiento de los LiT CD8+ presentes en tumor, juxtatumor y ganglios drenantes invadidos y no invadidos de pacientes con carcinoma ductal o lobulillar invasor de mama que normalmente no son considerados como candidatos a inmunoterapia. Al igual que lo observado en los modelos murinos de tumor, encontramos que los diferentes grados de expresión de PD-1 son un excelente marcador para identificar a LiT CD8+ en diferentes estadios de agotamiento. LiT CD8+ con alta expresión de PD-1 infiltrantes de tumor de pacientes con cáncer de mama representan a la población con mayor expresión de moléculas asociadas a agotamiento terminal como CD39, receptores inhibitorios, KI-67, el factor de transcripción TOX y moléculas citotóxicas como CD107, GrzB y perforinas y disminuida capacidad de producir citoquinas tales como TNF e IFN-γ. De manera interesante, esta población PD-1HIGH no es la más abundante dentro del tumor, si no que, las poblaciones más abundantes son las poblaciones PD-1NEG y PD-1-1INT las cuales presentan conservada capacidad de producir citoquinas. Este hallazgo plantea la consideración de pacientes con cáncer de mama como potenciales respondedores a terapias inmunes dirigidas a expandir y potenciar la funcionalidad de LiT CD8+. Por otro lado, realizamos un análisis de RNAseq de tumores obtenidos de bases de datos públicas (TCGA), los cuales arrojaron que, aquellos pacientes con cáncer de mama cuyos tumores presentan mayor expresión de genes como TOX, PD-1, perforinas y granzimas presentan una mejor probabilidad de supervivencia. Lo que nos lleva a postular la potencialidad de la población de LiT CD8+ PD-1HIGH TOX+ como marcador pronóstico en pacientes con cáncer de mama. La presencia de poblaciones PD-1INT pre-exhaustas tanto en tumor como en tejidos adyacentes y los resultados obtenidos en el análisis transcripcional, nos lleva a postular que estos pacientes presentan un gran potencial como candidatos a inmunoterapias que tengan como blanco a dicha población y que la misma contribuya a un mejor control de la patología.
In this doctoral thesis, we study the role of the ectoenzyme CD39 in modulating the anti-tumor response, with a focus on its effect on the population of CD8+ T cells exhibiting characteristics of exhaustion. To achieve a deeper understanding, we conducted analyses in three murine cancer models with different histological origins and immunogenicity. We demonstrated that the molecule PD-1 can identify tumor-infiltrating CD8+ T cells at various stages of exhaustion. In this context, we observed that higher PD-1 expression positively correlates with increased co- expression of surface inhibitory receptors, the expression of the exhaustion-specific transcription factor TOX, a reduced capacity to produce cytokines such as TNF and IFN-γ, and a high cytotoxic potential, evaluated by the expression of the degranulation marker CD107 and the cytotoxic molecules perforin and granzyme B. Our results show that CD8+ T cell populations with intermediate levels of PD-1 expression correspond to early exhaustion stages, while high levels of PD-1 expression correspond to terminal exhaustion stages. Focusing on the role of CD39 in the anti-tumor response, we found that in the colon carcinoma model (MC38), the absence of CD39 leads to better control of tumor progression, accompanied by a higher infiltration of CD45+ leukocytes and a greater percentage of terminally exhausted CD8+ T cells with high cytotoxic potential. In the melanoma model (B16F10), characterized by low CD8+ T cell infiltration, the absence of CD39 favors tumor progression control. This control is possibly due to the contribution of other cell populations since the absence of the ectoenzyme did not increase CD8+ T cell infiltration, and a deeper characterization of this population revealed a low percentage of cells with an effector phenotype. Notably, in the B16F10-OVA melanoma model, the absence of CD39 does not favor better control of tumor progression. However, we found a higher infiltration of OVA-specific effector phenotype CD8+ T cells. Additionally, tumors from CD39KO animals injected with the B16F10-OVA tumor line presented a higher infiltration of pre- exhausted CD8+ T cells. Next, we evaluated the impact of treatments that enhance the effector function of CD8+ T cells, such as the IL-2/α-IL-2 complex (IL-2cx), in combination with the absence or pharmacological inhibition (POM-1) of CD39. We found that the absence of CD39 did not enhance the effect on tumor control mediated by IL-2cx. On the other hand, treatment with POM-1 when the tumor is palpable, together with IL-2cx, favors the control of tumor progression compared to monotherapy with IL-2cx or no treatment. Additionally, it leads to an increase in pre-exhausted CD8+ T cells expressing markers of terminally exhausted CD8+ T cells, such as the transcription factor TOX and perforin, indicating a greater cytotoxic potential. These results highlight the importance of considering CD39 as a potential therapeutic target to improve the anti-tumor response in different types of cancer, both in patients with cold tumors, which are considered to have a worse prognosis, and in patients who are poor responders to conventional therapies. We also evaluated, through in vitro stimulation of naive CD8+ T cells, the involvement of signals present in the tumor microenvironment in the induction of CD39 and other exhaustion characteristics in this population. Our results reveal that TCR stimulation is necessary for the induction of CD39 and that the presence of cytokines such as IL-6 and IL-27, together with TCR signaling, favors this expression. We also demonstrated that these signals induce other exhaustion characteristics in the CD39+ CD8+ T cell population, such as co-expression of inhibitory receptors and transcription factors associated with exhaustion. However, the stimulation conditions used were not sufficient to bring CD39+ CD8+ T cells to an advanced stage of exhaustion, as they did not show a compromised ability to produce effector cytokines such as TNF. Finally, in this doctoral thesis, we conducted a study of the different stages of exhaustion of CD8+ T cells present in the tumor, peritumoral area, and invaded and non-invaded draining lymph nodes of patients with invasive ductal or lobular breast carcinoma, who are not normally considered candidates for immunotherapy. Similar to what was observed in murine tumor models, we found that different levels of PD-1 expression are an excellent marker for identifying CD8+ T cells at various stages of exhaustion. CD8+ T cells with high PD-1 expression infiltrating the tumors of breast cancer patients represent the population with the highest expression of terminal exhaustion- associated molecules such as CD39, inhibitory receptors, KI-67, the transcription factor TOX, and cytotoxic molecules like CD107, GrzB, and perforin, with a reduced capacity to produce cytokines such as TNF and IFN-γ. Interestingly, this PD-1HIGH population is not the most abundant within the tumor; rather, the most abundant populations are the PD-1NEG and PD-1INT populations, which retain their cytokine production capacity. This finding suggests that breast cancer patients could potentially respond to immune therapies aimed at expanding and enhancing the functionality of CD8+ T cells. Additionally, we conducted an RNAseq analysis of tumors obtained from public databases (TCGA), which revealed that breast cancer patients with tumors expressing higher levels of genes such as TOX, PD-1, perforin, and granzymes have a better probability of survival. This leads us to propose the potential of the PD-1HIGH TOX+ CD8+ T cell population as a prognostic marker in breast cancer patients. The presence of PD-1INT pre-exhausted populations in both the tumor and adjacent tissues, along with the results obtained from the transcriptional analysis, leads us to propose that these patients have great potential as candidates for immunotherapies targeting this population, contributing to better disease control.

• Main Author: Abrate, Carolina Paola Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas
• Other Authors: Montes, Carolina Lucia Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (Thesis advisor), Stempin, Cinthia Carolina Universidad Nacional de Córdoba. Faculta de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (cths), Prucca, César Germán Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica.Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (CIQUIBIC) (cths), Irazoqui, Fernando José Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (cths), Levy, Estrella Mariel Fundación para la Investigación, Docencia y Prevención del Cáncer (FUCA). Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (evl)
• Format: Thesis eBook
• Language: Spanish
• Published: Córdoba : [s. n.], 2024
• Subjects: Enzimas; Neoplasias; Inmunología; Citocinas; Neoplasias del Colon
• Item Description: Universidad Nacional de Córdoba Facultad de Ciencias Químicas Departamento de Bioquímica Clínica Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI-CONICET)
• Physical Description: 1 Archivo PDF : [recurso electrónico], 12,7 MB