Regulación dependiente de calcio de la vía de señalización de PERK /
El retículo endoplásmico (RE) es un orgánulo dinámico donde se llevan a cabo numerosas y variadas funciones. Las mismas solo se pueden lograr si la concentración de Ca2+ en el lumen del RE es óptima. Cuando la función normal del RE se ve comprometida, y/o la carga de proteínas recién sintetizadas ex...
| Main Author: | |
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| Other Authors: | , , , , |
| Format: | Thesis eBook |
| Language: | English Spanish |
| Published: |
Córdoba :
[s. n.],
2024
|
| Subjects: |
MARC
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| 100 | |a Fernández, Macarena |c Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. |9 13482 | ||
| 245 | |a Regulación dependiente de calcio de la vía de señalización de PERK / |c Macarena Fernández. - - |h [recurso electrónico] | ||
| 260 | |a Córdoba : |b [s. n.], |c 2024 | ||
| 300 | |a 1 Archivo PDF : |b [recurso electrónico]; |c 5 MB | ||
| 500 | |a Departamento de Bioquímica y Biofísica Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra INIMEC-CONICET-UNC Córdoba, Argentina – 2024 | ||
| 502 | |a Tesis (Doctora en Ciencias Químicas) - - Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas, 2024. | ||
| 520 | |a El retículo endoplásmico (RE) es un orgánulo dinámico donde se llevan a cabo numerosas y variadas funciones. Las mismas solo se pueden lograr si la concentración de Ca2+ en el lumen del RE es óptima. Cuando la función normal del RE se ve comprometida, y/o la carga de proteínas recién sintetizadas excede la capacidad de plegamiento del orgánulo, se desencadena una condición de estrés en el RE. Para restaurar la homeostasis, se activa un complejo sistema de transducción de señales denominada Respuesta a las proteínas mal plegadas o UPR (sigla derivada del inglés: Unfolded Protein Response). Una respuesta inmediata es la atenuación de la síntesis proteica debido a la activación de una proteína de transmembrana de RE con actividad quinasa: PERK (del inglés: PKR-like ER-associated Kinase). La misma, en condiciones basales, se encuentra inactiva debido a la asociación de su dominio luminal con la chaperona BiP (del inglés: Binding immunoglobin protein). En situaciones de estrés de RE, las proteínas mal plegadas se acumulan en el orgánulo y compiten por su unión a BiP. Esto induce la oligomerización, trans-autofosforilación y activación de la actividad quinasa de PERK que conlleva a un aumento del nivel de la subunidad α del factor de iniciación (eIF2α) fosforilado, repercutiendo en la atenuación de la síntesis proteica global (Rutkowski and Kaufman, 2007). Nuestro grupo de trabajo ha descrito una función no canónica de Calcineurina (CN), proteína citosólica heterodimérica, constituída por una subunidad catalítica A (CN-A) y una regulatoria B (CN-B). Este nuevo papel de CN, está relacionado con la UPR y con un claro efecto citoprotector que fue observado en distintos sistemas celulares y modelos in vivo de isquemias cerebrales locales. Además, sólidas evidencias indican que este efecto es dependiente de PERK y es favorecido por aumentos moderados de la concentración de Ca2+ citosólica (Bollo et al., 2010; Chen et al., 2016). Recientemente nuestro grupo de investigación demostró, en células estresadas, una liberación activa de Ca2+ a través del translocón, complejo proteico cuyo poro está conformado por la subunidad Sec61α, generando microdominios citosólicos del ion (Feliziani et al., 2022), constituyendo la primera evidencia de una señal de Ca2+ desencadenada por un estresor. Aunque el Ca2+ es una señal versátil capaz de regular muy diversas funciones celulares; se desconoce su papel en la restauración de la homeostasis una vez iniciada la UPR y, en particular, como la señal de Ca2+ generada por el translocón es decodificada, adquiriendo así relevancia con impacto fisiológico. En conjunto dichos antecedentes nos condujeron a plantear la siguiente hipótesis: “Bajo condiciones de estrés, los microdominios de Ca2+ inducidos por un aumento de la liberación del ion (a través del translocón) son detectados por los dominios manos-EF (motivos de unión al calcio, constituidos por dos hélices E y F) de la subunidad B de Calcineurina. En consecuencia, se favorece la interacción CN-PERK, repercutiendo en un incremento de la autofosforilación y de la actividad quinasa; lo cual, a su vez, es facilitado por la formación de un complejo macromolecular entre Sec61α, PERK y CN”. Para abordar esta hipótesis, se utilizaron herramientas farmacológicas que modulan la actividad del translocón, un quelante intracelular de Ca2+ y una línea celular deficiente para las 3 isoformas del receptor de IP3 (HEK TKO-IP3R). Para inducir estrés de RE se empleó Tunicamicina (Tm), un inhibidor de la glicosilación. Los resultados obtenidos indican que tanto los niveles de P-PERK, P-eIF2α como la interacción entre P-PERK-Sec61α, y entre PERK y ambas subunidades de CN (CN-Aβ/CN-B), son favorecidas por los incrementos moderados de Ca2+ citosólico, liberado a través del translocón. Además, en células deficientes en la CN-B se sobreexpresó la proteína wild type CN-B o su mutante en los sitios de unión a Ca2+ (manos-EF). Posteriormente, se observó que solo las células que sobreexpresaban la CN-B wild type fueron capaces de inducir incrementos significativos del producto de la activación de PERK, P-eIF2α. Permitiendo confirmar que esta subunidad de CN interviene en la detección del ion en el sistema de señal de Ca2+ en estudio. También se demostró, mediante un sistema de geles de 2 dimensiones (gel nativo seguido de un SDS-PAGE), que luego de inducir el tratamiento con Tm en células HEK TKO-IP3R, PERK forma un complejo macromolecular con el poro del translocón (Sec61α) y CN-(A/B). Observamos que PERK participa, de manera dinámica, principalmente en tres ensambles proteicos de distinto peso molecular, donde la relación P-PERK/PERK varía según la condición experimental. Interesantemente, Sec61α y CN-(A/B) solo forman parte del complejo II de peso molecular intermedio. La formación del mismo posibilita optimizar la detección de los aumentos de [Ca2+] inducidos por estrés de RE, incrementando la activación de la actividad quinasa y, por lo tanto, la transducción de la señal aguas abajo. | ||
| 520 | |a The endoplasmic reticulum (ER) is a dynamic organelle where numerous and varied functions take place. These functions can only be achieved if the concentration of Ca2+ in the ER lumen is optimal. When the normal function of the ER is compromised, and/or the load of newly synthesized proteins exceeds the folding capacity of the organelle, ER stress is triggered. To restore homeostasis, a complex signaling system called the Unfolded Protein Response (UPR) is activated. An immediate response is the attenuation of protein synthesis due to the activation of an ER transmembrane protein with kinase activity: PERK (PKR-like ER-associated Kinase). Under basal conditions, PERK is inactive due to its association with the chaperone BiP (Binding immunoglobulin protein). In situations of ER stress, misfolded proteins accumulate in the organelle and compete for binding to BiP. This induces oligomerization, trans-autophosphorylation, and activation of PERK kinase activity, leading to an increase in the level of phosphorylated eIF2α (eukaryotic translation initiation factor 2α), resulting in global attenuation of protein synthesis (Rutkowski and Kaufman, 2007). Our research group has described a non-canonical function of Calcineurin (CN), a heterodimeric cytosolic protein consisting of a catalytic A subunit (CN-A) and a regulatory B subunit (CN-B). This new role of CN is related to UPR and has a clear cytoprotective effect observed in different cellular systems and in vivo models of local cerebral ischemia. Moreover, robust evidence indicates that this effect is dependent on PERK and is favored by moderate increases in cytosolic Ca2+ concentration (Bollo et al., 2010; Chen et al., 2016). Recently, our research group demonstrated, in stressed cells, an active release of Ca2+ through the translocon, a protein complex whose pore is formed by the Sec61α subunit, generating cytosolic ion microdomains (Feliziani et al., 2022), constituting the first evidence of a Ca2+ signal triggered by a stressor. Although Ca2+ is a versatile signal capable of regulating various cellular functions, its role in restoring homeostasis once the UPR is initiated is unknown, particularly how the Ca2+ signal generated by the translocon is decoded, gaining physiological relevance. Taken together, these findings led us to propose the following hypothesis: "Under stress conditions, Ca2+ microdomains induced by an increase in ion release (via the translocon) are detected by the EF-hand domains (calcium-binding motifs consisting of two E and F helices) of the Calcineurin B subunit. Consequently, the CN-PERK interaction is favored, resulting in an increase in autophosphorylation and kinase activity, which, in turn, is facilitated by the formation of a macromolecular complex between Sec61α, PERK, and CN". To address this hypothesis, pharmacological tools that modulate translocon activity, an intracellular Ca2+ chelator, and a cell line deficient in all 3 isoforms of the IP3 receptor (HEK TKO-IP3R) were used. Tunicamycin (Tm), an inhibitor of glycosylation, was employed to induce ER stress. The results obtained indicate that moderate increases in cytosolic Ca2+, released through the translocon, favor the levels of P-PERK, P-eIF2α, as well as the interaction between P-PERK-Sec61α, and between PERK and both CN subunits (CN-Aβ/CN-B). Additionally, in cells deficient in CN-B, wild type CN-B protein or its mutant at the Ca2+ binding sites (EF-hands) was overexpressed. Subsequently, it was observed that only cells overexpressing wild type CN-B were able to induce significant increases in the PERK product, P-eIF2α. This confirmed that this CN subunit is involved in ion detection in the studied Ca2+ signaling system. Furthermore, using a two-dimensional gel system (native gel followed by SDS-PAGE), it was demonstrated that after inducing Tm treatment in HEK TKO-IP3R cells, PERK forms a macromolecular complex with the translocon pore (Sec61α) and CN-(A/B). It was observed that PERK dynamically participates in three distinct protein assemblies of different molecular weights, where the P-PERK/PERK ratio varies according to the experimental condition. Interestingly, Sec61α and CN-(A/B) are only part of the intermediate molecular weight complex II. The formation of this complex optimizes the detection of stress-induced [Ca2+] increases, enhancing the activation of kinase activity and, therefore, downstream signal transduction. | ||
| 650 | 7 | |a Reticulo endoplasmatico |9 1735 | |
| 650 | 7 | |a Quinasa [enzima activada] |9 1499 | |
| 650 | 7 | |a Señalización del calcio |9 1359 | |
| 650 | 7 | |a Calcio |9 815 | |
| 650 | 7 | |a Homeostasis |9 1511 | |
| 650 | 7 | |a Proteínas |9 595 | |
| 650 | 7 | |a Macromoleculas |9 431 | |
| 650 | 7 | |a Fosforilación |9 1871 | |
| 700 | |a Bollo, Mariana Inés |c Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigación Médica Mercedes y Martín Ferreyra (INIMEC). |9 13481 |e ths | ||
| 700 | 1 | |a Panzetta de Dutari, Graciela María Del Valle |c Universidad Nacional de Córdoba. |c Facultad de Ciencias Químicas. |c Departamento de Bioquímica Clínica. |c Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. |c Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología. |9 6380 |e cths | |
| 700 | 1 | |a Galiano, Mauricio R. |c Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica; Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (CIQUIBIC). |9 4061 |e cths | |
| 700 | 1 | |a Vilcaes, Aldo Alejandro |c Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. |9 8026 |e cths | |
| 700 | 1 | |a Casale, César Horacio |c Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Biotecnología Ambiental y Salud (INBIAS). |9 10251 |e evl | |
| 856 | |z Este documento se encuentra disponible en el Repositorio Digital de la Universidad Nacional de Córdoba, Argentina. |z https://rdu.unc.edu.ar/ |z Embargo de visualización en RDU: Desde el 01 de mayo de 2024 hasta el 30 de abril de 2026. | ||
| 942 | |2 ddc |c TF | ||
| 945 | |a jml |f 24/5/2024 | ||
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