Estudios sobre la maquinaria molecular y la regulación circadiana del metabolismo en células de hepatocarcinoma humano /

Resumen: El hígado es un órgano crucial para la fisiología como integrador metabólico y centro regulador de la homeostasis lipídica y energética, ya que participa en el metabolismo de los triglicéridos (TG) y los glicerofosfolípidos (GFL). Diferentes factores pueden causar trastornos metabólicos que promueven una acumulación anormal de lípidos en orgánulos llamados gotas lipídicas (GLs) causando esteatosis hepática, que es la manifestación del síndrome metabólico, y que puede progresar a carcinoma hepatocelular (HCC), la neoplasia maligna hepática más común en todo el mundo. La vida moderna (trabajo por turnos rotativos, jet-lag crónico, trabajos nocturnos, exposiciones prolongadas a luces artificiales en horarios nocturnos, etc.) implica condiciones que afectan el normal funcionamiento del reloj biológico causando trastornos metabólicos y un mayor riesgo de cáncer. El hígado contiene un sistema circadiano, al igual que otros órganos y tejidos e incluso líneas celulares inmortalizadas derivadas de este órgano, que regula los ritmos transcripcionales y metabólicos, controlando así temporalmente diversos procesos. El reloj molecular está conformado por genes reloj (BMAL1, PER1/2, REV-ERB) y controla la expresión rítmica de muchos otros llamados genes controlados por reloj (Colina Quinasa, CHOK). Se desconoce al presente el funcionamiento del reloj celular en células hepáticas tumorales y la implicancia del reloj molecular sobre el metabolismo lipídico y bioenergético en estas células, y su perfil oscilatorio. Hemos descrito previamente en estudios in vivo en hígado de ratones, y en distintos modelos celulares bajo condiciones fisiológicas, que el metabolismo de GFLs se encuentra estrechamente regulado por el reloj circadiano, en particular la síntesis de fosfatidilcolina (PC) y de su enzima regulatoria colina Quinasa (CHOK), como así también distintas aciltransferasas y fosfatidato fosfohidrolasa 1 (PAP1). En este trabajo investigamos en células HepG2, una línea celular derivada del HCC, los ritmos metabólicos y su vínculo con el reloj circadiano en condiciones control (B-WT) y en condiciones donde el reloj molecular ha sido dañado (disrupción de BMAL1, B-D) mediante la tecnología del CRISPR/Cas9. En las células B-WT mantenidas en condiciones de proliferación (con suero) y sincronizadas con dexametasona (DEX), se observaron ritmos autosostenidos en la expresión de las enzimas involucradas en la biosíntesis de glicerolípidos CHOKα (ARNm y proteína), PCYT2 (citidil transferasa de fosfatidiletanolamina (PE)) y PAP1, y en el metabolismo de los GFLs más abundantes (PC y PE), TG y contenido de GLs. Por el contrario, luego de la disrupción del reloj circadiano (modelo B-D), todo el metabolismo hepático se vio severamente alterado con una reducción significativa en el contenido de PC, TG y GLs, así como en los ritmos de CHOKα (ARNm y proteína) y otras enzimas del metabolismo lipídico. Los resultados sugieren un estrecho vínculo entre el reloj molecular y el metabolismo lipídico, como se aprecia en células B-D que exhiben una marcada alteración en el almacenamiento y síntesis de lípidos al igual que en el metabolismo energético, como consecuencia de la disrupción de BMAL1. Esto pone de manifiesto que un reloj funcional continúa operativo en células tumorales en proliferación, lo que las vuelve susceptibles a perturbaciones y de este modo afectar su metabolismo.
Abstract: The liver is a crucial organ to physiology as a major metabolic integrator and a central hub for lipid and energy homeostasis, being involved in triglyceride (TG) and glycerophospholipid (GPL) metabolism. Different factors may cause metabolic disorders promoting an abnormal lipid accumulation in organelles called lipid droplets (LDs) causing hepatic steatosis- which is the metabolic syndrome manifestation, and it can progress to a human hepatocellular carcinoma (HCC), the most common primary liver malignancy worldwide. Modern life (shift work, jetlag, etc.) involves conditions that disrupt the biological clock causing metabolic disorders and higher cancer risk. A circadian clock is present in the liver and in immortalized cell lines, and temporally regulates physiological processes by driving transcriptional and metabolic rhythms. A molecular clock drives the expression of clock genes (BMAL1, PER1/2, REV-ERB) and clock-controlled genes (Choline Kinase, CHOK) along 24 h. At present, little is known about the functioning of the biological clock in tumor hepatic cells and the link between the molecular clock and the lipid metabolism and oscillatory profiles. We have previously described that the synthesis of GPLs is tightly controlled by the circadian clock in the murine liver in vivo and immortalized cell lines under physiological conditions, mainly for PC the most abundant GPL and its regulatory enzyme CHOK, as well as other acyltransferases and phosphatidate phosphohydrolase (PAP1). Here we investigated in HepG2 cells, a HCC-derived cell line, kept under proliferation and synchronized with dexamethasone (DEX), metabolic rhythms and their link with the circadian clock in control (B-WT) and BMAL1-knocked down (B-D) cells having the molecular clock disrupted by CRISPR/Cas9. In B-WT cells rhythms in expression of lipid synthesizing enzymes CHOKα (mRNA and protein), PCYT2 and PAP1, and in the metabolism of particular GPLs (phosphatidylcholine PC and phosphatidylethanolamine PE), TGs, and LD content were observed. By contrast, when the circadian clock was disrupted (B-D model), the whole hepatic metabolism was severely altered with a significant damping in TGs and LD content as well as in rhythms of CHOKα (mRNA and protein) and other enzymes. The results suggest a close link between the molecular clock and the lipid metabolism, which exhibits an alteration in lipid storage and synthesis and energy metabolism in B-D cells, as a consequence of BMAL1 disruption. This shows that a functional clock continues to operate in proliferating tumor cells, which makes them susceptible to disturbances and thus affect their metabolism.

• Main Author: Monjes, Natalia Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas
• Other Authors: Guido, Mario Eduardo Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (Thesis advisor), Soria, Gastón Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (cths), Nicola, Juan Pablo Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Ténicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (cths), Garbarino Pico, Eduardo (cths), Ves Losada, Ana Universidad Nacional de La Plata. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Instituto de Investigaciones Bioquímicas de La Plata "Prof. Dr. Rodolfo R. Brenner" (INIBIOLP) (evl)
• Format: Thesis eBook
• Language: Spanish
• Published: Córdoba : [s. n.], 2022
• Subjects: Ritmo circadiano; Glicerofosfolipidos; Fosfolípidos; Lipidos; Higado; Sindrome x metabolico; Metabolismo energético; Metabolismo; Metabolismo lipidico; Transferasas
• Item Description: Trabajo realizado en: Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (CIQUIBIC).
• Physical Description: 1 Archivo PDF : [recurso electrónico], 14,8 MB.
• Audience: Director de tesis: Dr. Mario Eduardo Guido. Comisión de tesis: Dres. Gastón Ramiro Soria, Juan Pablo Nicola y Eduardo Garbarino Pico. Evaluador externo: Dra. Ana Ves Losada