Estudio fenotípico y funcional de linfocitos T convencionales CD39+ en el contexto de la respuesta inmune antitumoral /

En este trabajo de tesis se describe una población particular de linfocitos T convencionales CD39+ (LiT CD4 + FOXP3-) que infiltran tumores murinos de distinto origen histológico y están ausentes en ganglios drenantes y bazo de estos animales. Esta población de LiT constituye un grupo heterogéneo de células clonalmente expandidas en el microambiente tumoral y exhiben característica de agotamiento y citotoxicidad. Los LiT convencionales que expresan CD39+ también infiltran tumores y ganglios metástasis y están ausentes en ganglios no metastásicos y en sangre periférica en paciencia con cáncer de mamá.
Numerosos estudios han demostrado que el éxito de la respuesta contra el cáncer requiere de la acción coordinada de distintas poblaciones del sistema inmune. Dentro de las células del sistema inmune, los LiT CD8 tienen un rol fundamental en la respuesta inmune antitumoral. En el microambiente tumoral (MAT) se encuentran dos subpoblaciones de LiT CD4: los LiT regulatorios (LiTreg) y los LiT convencionales (LiTconv). Estudios recientes postulan a los LiTconv como partícipes clave en la respuesta antitumoral ya que son capaces de eliminar células tumorales de manera directa a través de mecanismos citolíticos, o de manera indirecta modulando el MAT. Reportes previos de nuestro laboratorio han demostrado que CD39 se expresa en múltiples poblaciones celulares infiltrantes de tumores como son los LiT CD8, LiTreg, células NK, LiTconv, entre otros. CD39 es una ecto-enzima que junto con CD73 participa en la generación de adenosina. Más recientemente, se ha identificado a CD39 como un marcador de LiT CD8 exhaustos. En el marco de este trabajo de tesis postulamos que la prolongada exposición de LiTconv a estímulos inflamatorios e inmunosupresores característicos del MAT, favorece la plasticidad de los mismos, modificando su fenotipo y funcionalidad. El MAT provee señales que llevan a la expresión de moléculas como CD39. Dicha molécula podría ser utilizada como un marcador de una población de LiTconv con características distintivas de una población infiltrante de tumor. Así, nos propusimos como objetivo realizar un estudio fenotípico, funcional y transcripcional de la población de LiTconv CD39+ infiltrantes de tumores de animales de experimentación y de pacientes con cáncer de mama y evaluar si esta población tiene potencialidad de impactar en la respuesta inmune antitumoral. Utilizando distintos modelos experimentales murinos de cáncer observamos que en el MAT una elevada frecuencia de LiTconv adquiere la expresión de CD39, mientras que en bazo y ganglios drenantes (GDs) de estos animales, la población de LiTconv CD39+ estaba prácticamente ausente. Estos resultados indican que la expresión de CD39 en LiTconv podría deberse a señales que reciben en el MAT. Además, observamos, que la frecuencia de LiTconv CD39+ infiltrantes de tumores de animales inyectados con la línea B16F10-OVA aumenta a lo largo de los días post inyección y que, una determinada frecuencia de esta población expresa también CD73. Por otro lado, determinamos que LiTconv CD39+ se asocian a focos de hipoxia en el MAT. Asimismo, los LiTconv CD39+ infiltrantes de tumores exhibieron características de LiT activados ya que presentaron activación de la vía de mTOR y un estadio de diferenciación de LiT de memoria efectora. Estudios de transferencia adoptiva, en consonancia con estudios de la diversidad de los TCRs, nos permitieron postular que esta población celular corresponde muy probablemente a LiT específicos para Ag tumorales, ya que muestra expansión clonal en el MAT. Por otro lado, el perfil transcripcional de LiTconv CD39+ infiltrantes de tumores fue compatible con el observado para LiT exhaustos. Estos resultados fueron corroborados por citometría de flujo mediante la evaluación de la expresión de diversos Receptores Inhibitorios (RIs). Respecto a la población de LiT conv CD39-, los LiTconv CD39+ mostraron una mayor expresión de RIs como PD-1, TIGIT, LAG-3 y Tim-3, entre otros, y mayor co-expresión de múltiples RIs. Asimismo, la expresión de RIs fue heterogénea, ya que encontramos células con alta y moderada expresión de RIs. Además, los LiTconv que expresan la ecto-enzima, exhibieron mayor expresión de factores de transcripción asociados a agotamiento como Eomes, T-bet, Blimp-1, TOX, Helios y C-Maf. En consonancia, los LiTconv CD39+ mostraron una comprometida capacidad de producir TNF, pero una alta capacidad de producir IFNγ. Sin embargo, no produjeron IL-10 ni IL-21. El estudio del perfil transcripcional de LiTconv CD39+ también reveló características de células citotóxicas. El análisis de expresión diferencial de genes mostró up-regulación de genes correspondientes a la vía de la citólisis como Gzmb, Gzmc, Gzme, Prf1, entre otros. El estudio funcional de esta población mostró la capacidad de estas células de producir Granzima B y Perforina-1, además de la alta expresión de CD107a, un marcador de degranulación. Las terapias con anti-CTLA-4 y anti-PD-1 tienen como blanco diferentes poblaciones de LiT infiltrantes de tumor. Así, nos preguntamos si el bloqueo de CTLA-4 podría afectar a la población de LiTconv CD39+ infiltrantes de tumores. El tratamiento de animales inyectados con la línea tumoral MC38 con anti-CTLA-4, ocasionó una disminución de la masa tumoral de los ratones, así como también indujo una expansión de la población de LiTconv CD39+, los cuales mantuvieron su perfil efector compatible con células exhaustas y citotóxicas, pero presentaron un aumento en la expresión de T-bet, que muy probablemente implique un aumento en la capacidad de producir IFNγ. En este trabajo de tesis nos propusimos correlacionar los hallazgos realizados en modelos experimentales con lo que ocurre con pacientes con cáncer. Así, observamos que los tumores de pacientes con cáncer de mama estaban infiltrados con una población de LiTconv CD39+. Llamativamente, se observó una mayor frecuencia de LiTconv CD39+ en tumores respecto de tejido adyacente sano, y en GDs invadidos por células tumorales respecto de GDs no invadidos, mientras que en sangre periférica no se detectaron estas células. Estos resultados indicarían que, como ocurre en los modelos murinos, la expresión de CD39 en LiTconv de pacientes con cáncer podría deberse a señales que reciben en el MAT. Además, el análisis fenotípico y funcional de LiTconv CD39+ demostró que dicha población presentaba características tanto de células exhaustas como de células citotóxicas. Así, LiTconv CD39+, comparado a LiTconv CD39-, presentaron una alta y múltiple expresión de RIs aunque la expresión de éstos fue heterogénea. También, mostraron una reducida capacidad de producir TNF, pero no mostraron una disminución en la frecuencia de células productoras de IFNγ e IL-2. Adicionalmente, LiTconv CD39+ exhibieron una mayor frecuencia de células CD107a+. Por otro lado, demostramos que la alta expresión de CD39 en LiTconv correlaciona con una mayor sobrevida en una cohorte de pacientes con cáncer de mama y melanoma. Por último, demostramos que la estimulación de LiTconv CD39- de pacientes con cáncer de mama con señales a través del TCR, es suficiente para inducir la expresión de CD39. Los resultados de esta tesis doctoral ponen en relevancia el estudio de la población de LiTconv CD39+. Además, nos motivan a pensar a los LiT agotados o exhaustos como una población de células T que, si bien tienen funciones efectoras comprometidas, en el MAT pueden adquirir funciones no canónicas tales como la capacidad citotóxica. Así, la compresión de las complejas funciones efectoras que pueden tener los LiTconv CD39+ en el MAT podría contribuir al desarrollo de posibles herramientas a utilizar en la inmunoterapia contra el cáncer.
Numerous studies have shown that the success of the response against cancer requires the coordinated action of different populations of the immune system. LiT CD8 have been considered as the main armed arm of the antitumor immune response. Two CD4 LiT subpopulations are found in the tumor microenvironment (TME): regulatory LiT (LiTreg) and conventional LiT (LiTconv). Recent studies postulate LiTconv as key participants in the antitumor response since they are capable of directly eliminating tumor cells through cytolytic mechanisms, or indirectly by modulating TME. Previous reports from our laboratory have shown that CD39 is expressed in multiple tumor-infiltrating cell populations such as LiT CD8, LiTreg, NK cells, LiTconv, among others. CD39 is an ecto-enzyme that, together with CD73, participates in the generation of adenosine. More recently, CD39 has been identified as a marker of exhausted LiT CD8. In this thesis, we postulate that the prolonged exposure of LiTconv to inflammatory and immunosuppressive stimuli characteristic of TME favors their plasticity, modifying their phenotype and functionality. The TME provides signals that lead to the expression of molecules such as CD39. This molecule could be used as a marker of a population of LiTconv with distinctive characteristics of a tumor-infiltrating population. Thus, we set ourselves the objective of conducting a phenotypic, functional and transcriptional study of the population of tumor-infiltrating CD39+ LiTconv of experimental animals and patients with breast cancer and evaluating whether this population has the potential to impact the antitumor immune response. Using different murine experimental models of cancer, we observed that in the TME a high frequency of LiTconv acquires the expression of CD39, while in the spleen and draining lymph nodes (DLs) of these animals, the population of CD39+ LiTconv was practically absent. These results indicate that the expression of CD39 in LiTconv could be induced by signals that they receive in the TME. In addition, we observed that the frequency of tumor-infiltrating CD39+ LiTconv of animals injected with the B16F10-OVA line increases over the days post injection and that a certain frequency of this population also expresses CD73. On the other hand, we determined that CD39+ LiTconv are associated with foci of hypoxia within the TME. Likewise, tumor-infiltrating CD39+ LiTconv exhibited characteristics of activated LiT as they exhibited activation of the mTOR pathway and an effector memory LiT differentiation stage. Adoptive transfer studies, consistent with studies of the diversity of TCRs, allowed us to postulate that this cell population most likely corresponds to LiT specific for tumor Ag, since it shows clonal expansion in the TME. On the other hand, the transcriptional profile of tumor-infiltrating CD39+ LiTconv was consistent with a phenotype of exhausted LiT. These results were corroborated by flow cytometry by evaluating the expression of various Inhibitory Receptors (IRs). Compared to the population of CD39- LiTconv, CD39+ LiTconv showed a higher expression of IRs such as PD-1, TIGIT, LAG-3 and Tim-3, among others, and higher co-expression of multiple IRs. Likewise, the expression of IRs was heterogeneous, since we found cells with high and moderate expression of IRs. In addition, LiTconv expressing the ecto-enzyme exhibited higher expression of exhaustion associated transcription factors such as Eomes, T-bet, Blimp-1, TOX, Helios, and C-Maf. Correspondingly, CD39+ LiTconv showed a compromised ability to produce TNF, but a high ability to produce IFNγ. However, they did not produce IL-10 or IL-21. The study of the transcriptional profile of CD39+ LiTconv also revealed characteristics of cytotoxic cells. Differential gene expression analysis showed up-regulation of genes corresponding to the cytolysis pathway such as Gzmb, Gzmc, Gzme, Prf1, among others. The functional study of this population showed the ability of these cells to produce Granzyme B and Perforin-1, in addition to the high expression of CD107a, a degranulation marker. Anti-CTLA-4 and anti-PD-1 therapies target different populations of tumor-infiltrating LiT. Thus, we wonder if CTLA-4 blockade could affect the population of tumor-infiltrating CD39+ LiTconv. The treatment of animals injected with the MC38 tumor line with anti-CTLA-4 caused a decrease in the tumor mass of the mice, as well as an expansion of the population of CD39+ LiTconv, which maintained their effector profile compatible with exhausted and cytotoxic cells. Also, CD39+ LiTconv showed an increase in the expression of T-bet, which most likely implies an increase in the ability to produce IFNγ. To extrapolate the results obtained in mice models to human cancer, we evaluated tumor-infiltrating cells from breast cancer patientis. Thus, we observed that tumors from patients with breast cancer were infiltrated with a population of CD39+ LiTconv. Interestingly, a higher frequency of CD39+ LiTconv was observed in tumors compared to healthy adjacent tissue, and in DLs invaded by tumor cells compared to non-invaded DLs, while these cells were not detected in peripheral blood. These results would indicate that, as occurs in murine models, the expression of CD39 in LiTconv from cancer patients could be induced by signals received in the TME. In addition, the phenotypic and functional analysis of CD39+ LiTconv showed that this population presented characteristics of both exhausted and cytotoxic cells. Thus, CD39+ LiTconv, compared to CD39- LiTconv, presented a high and multiple expression of IRs, although their expression was heterogeneous. Also, they showed a reduced ability to produce TNF, but did not show a decrease in the frequency of IFNγ-producing cells and IL-2-producing cells. Additionally, CD39+ LiTconv exhibited a higher frequency of CD107a+ cells. On the other hand, we showed that the high expression of CD39 in LiTconv correlates with a longer survival in a cohort of patients with breast cancer and melanoma. Finally, we showed that stimulation of CD3- LiTconv from breast cancer patients with signals through the TCR is sufficient to induce CD39 expression. The results of this doctoral thesis highlight the study of the CD39+ LiTconv population. In addition, they motivate us to think of exhausted LiT as a population of T cells that, although they have compromised effector functions, in the TME can acquire non-canonical functions such as cytotoxic capacity. Thus, the understanding of the complex effector functions that CD39+ LiTconv may have in the TME could contribute to the development of possible tools to be used in cancer immunotherapy

• Main Author: Bossio, Sabrina N. Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas
• Other Authors: Montes, Carolina Lucia Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (Thesis advisor), Maccioni, Mariana Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Bioquímica Clínica e Inmunología (cths), Lorenzo, Alfredo Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Farmacología (cths), Gil, German Alejandro Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (cths), Alanis, Laura Universidad Nacional de San Antonio de Areco. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones y Transferencia del Noroeste de la Provincia de Buenos Aires (evl)
• Format: Thesis eBook
• Language: Spanish
• Published: Córdoba : [s. n.], 2022
• Subjects: Linfocitos T; Ganglios linfaticos; Carcinogenos; Glandula tiroides; Neoplasias de la Tiroides; Neoplasias de la Mama
• Item Description: Trabajo realizado en: Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigación en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI).
• Physical Description: 1 Archivo PDF : [recurso electrónico], 33,2 MB
• Audience: Directora de tesis: Dra. Carolina Lucia Montes. Comisión de tesis: Dra. Mariana Maccioni, Dres. Alfredo Lorenzo y Germán A. Gil. Evaluadora externa: Dra. Laura Alanis