Rol de la proteína transportadora de lípidos StarD7 en la morfología, dinámica y función mitocondrial /
Resumen: Las mitocondrias son organelas esenciales para la supervivencia de las células eucariotas, ya que ejercen múltiples funciones bioquímicas, incluida la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS), la síntesis de aminoácidos, grupo hemo, lípidos y la biogénesis de los gr...
| Main Author: | |
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| Other Authors: | , , , , |
| Format: | Thesis eBook |
| Language: | Spanish |
| Published: |
Córdoba :
[s. n.],
2022
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| Subjects: |
| Summary: | Resumen: Las mitocondrias son organelas esenciales para la supervivencia de las células eucariotas, ya que ejercen múltiples funciones bioquímicas, incluida la producción de ATP a través de la fosforilación oxidativa (OXPHOS), la síntesis de aminoácidos, grupo hemo, lípidos y la biogénesis de los grupos de hierro y azufre. Experimentan cambios dinámicos en tamaño, forma, número y distribución dependiendo de estímulos fisiológicos y patológicos. Estos cambios adaptativos ocurren a través de ciclos coordinados de fisión y fusión de mitocondrias. Las proteínas mitofusina 1 (Mfn1) y 2 (Mfn2) localizadas en la membrana mitocondrial externa (MME) y la proteína Optic atrophy 1 (OPA1) que se encuentra en la membrana mitocondrial interna (MMI) forman parte de la maquinaria de fusión. Por otro lado, la proteína citosólica Dynamin-related 1 (Drp1) media los eventos de fisión mitocondrial. La composición lipídica de las membranas mitocondriales es fundamental para preservar la actividad y estabilidad de los complejos proteicos implicados en la función, distribución y biogénesis de esta organela. Las mitocondrias sintetizan varios lípidos como fosfatidilglicerol, cardiolipina, fosfatidiletanolamina y ácido fosfatídico; mientras que otros como fosfatidilcolina (PC), fosfatidilserina, fosfatidilinositol, esteroles y esfingolípidos, deben importarse de otras organelas, principalmente desde el retículo endoplásmico (RE). StarD7, implicada en el transporte de PC a la mitocondria, se sintetiza como una proteína precursora (StarD7.I) que contiene una señal de localización mitocondrial la cual se escinde en la mitocondria originando la isoforma madura StarD7.II, que se libera al citoplasma o permanece en el espacio intermembrana mitocondrial (EIM). En estudios previos se demostró que el knockdown de StarD7 induce alteraciones en las mitocondrias y el RE con una reducción en el contenido de PC; sin embargo, se desconoce si StarD7 modula la dinámica y función mitocondrial. En este trabajo de tesis se analizó la participación de StarD7 en la morfología, dinámica y función mitocondrial utilizando dos modelos celulares: la línea HTR-8/SVneo derivada de trofoblasto humano de primer trimestre y la línea de mioblastos C2C12 derivada de tejido muscular de ratón. Se generaron células HTR-8/SVneo y C2C12 que sobre-expresan establemente las isoformas StarD7.I (D7.I) y StarD7.II (D7.II). Además ambas líneas celulares se silenciaron en forma transiente (siD7) y estable (shD7). Se demostró en la línea HTR-8/SVneo que la sobre-expresión de D7.I altera la morfología mitocondrial aumentando su fragmentación, mientras que no se observaron cambios en las células que sobre-expresan D7.II en comparación con las células estables control (Ct). Las células D7.I estables transportan mayor cantidad de PC a las mitocondrias que las células Ct, producen fusiones mitocondriales, mantienen el potencial de membrana y generan niveles más bajos de especies reactivas de oxígeno (ERO). Además, expresan mayor nivel de las proteínas Drp1 y Mfn2, con menor cantidad de Mfn1. Por otro lado, las células D7.I transfectadas con plásmidos que codifican a las mutantes Drp1-K38A, Drp1-S637D o Drp1-S637A indican que el fenotipo mitocondrial observado es dependiente de la actividad GTPasa de Drp1 y del grado de fosforilación de la serina 637. En contraste, el silenciamiento de StarD7 en la línea celular HTR-8/SVneo disminuye la expresión de las proteínas de fusión Mfn1 y Mfn2 sin modificar la cantidad de Drp1. Además, se observó que estas células aumentan los niveles de ERO y presentan mitocondrias fragmentadas en forma de “donut”, indicativas de estrés metabólico (Rojas et al., 2021) En la línea C2C12, se demostró que cambios en los niveles de StarD7 no modifican la morfología mitocondrial, evidenciada mediante tinción con MitoTracker Deep Red. Tampoco alteran la expresión de las proteínas de fisión/fusión Mfn1, Mfn2, Drp1, ni la expresión de PCG1α implicada en la biogénesis mitocondrial. Sin embargo, las observaciones realizadas por microscopía electrónica muestran, en las células shD7, una significativa desorganización en sus crestas mitocondriales con menor expresión de L-OPA1, proteína involucrada en su remodelación y mantenimiento. Finalmente, se demostró que el silenciamiento de StarD7 en las células C2C12, disminuye el potencial de membrana, impide la diferenciación celular a miotubos, mientras que incrementa el ECAR (extracellular acidification rate), la captación de glucosa y la acumulación de lípidos neutros. En conjunto, estos hallazgos proporcionan evidencia novedosa que indica que las alteraciones en la expresión de StarD7 producen cambios significativos en la morfología, dinámica y función mitocondrial dependiente del contexto celular. Abstract: Mitochondria are essential organelles for the survival of eukaryotic cells, as they exert multiple biochemical functions, including the ATP production through oxidative phosphorylation, the synthesis of amino acids, heme group, lipids, and the biogenesis of iron and sulfur groups. They undergo dynamic changes in size, shape, number and distribution depending on physiological and pathological stimuli. These adaptive changes occur through coordinated cycles of fission and fusion. Mitofusin 1 (Mfn1) and 2 (Mfn2) proteins located in the outer mitochondrial membrane and the Optic atrophy 1 (OPA1) protein found in the inner mitochondrial membrane are part of the fusion machinery. On the other hand, the cytosolic protein Dynamin-related 1 (Drp1) mediates mitochondrial fission events. The lipid composition of mitochondrial membranes is essential to preserve the activity and stability of the protein complexes involved in the function, distribution and biogenesis of this organelle. Mitochondria synthesize various lipids such as phosphatidylglycerol, cardiolipin, phosphatidylethanolamine and phosphatidic acid; while others such as phosphatidylcholine (PC), phosphatidylserine, phosphatidylinositol, sterols and sphingolipids must be imported from other organelles, mainly from the endoplasmic reticulum (ER). StarD7 protein, involved in the transport of PC to the mitochondria, is synthesized as a precursor (StarD7.I) that contains a mitochondrial localization signal that is cleaved in mitochondria originating the mature isoform StarD7.II, which is released into the cytoplasm or remains in the mitochondrial intermembrane space. Previous studies have shown that StarD7 knockdown induces alterations in mitochondria and ER with a reduction in PC content; however, it is unknown whether StarD7 modulates mitochondrial dynamics and function. In this thesis, the participation of StarD7 in mitochondrial morphology, dynamics and function was analyzed using two cell models: the HTR-8/SVneo line derived from first trimester human trophoblast cells and the myoblast cell line C2C12 derived from murine skeletal muscle tissue. HTR-8/SVneo and C2C12 cells that stably overexpress the StarD7.I (D7.I) and StarD7.II (D7.II) isoforms were generated. In addition, both cellular lines were transiently (siD7) or stably (shD7) silenced against StarD7. It was demonstrated, in the HTR-8/SVneo cell line, that overexpression of D7.I alters mitochondrial morphology by increasing its fragmentation, while no changes were observed in cells that overexpress D7.II compared to stable control cells (Ct). D7.I stable cells transport higher amounts of PC to the mitochondria than Ct cells, produce mitochondrial fusions, maintain membrane potential, and generate lower levels of reactive oxygen species (ROS). In addition, they express a higher level of the proteins Drp1 and Mfn2, and less Mfn1. On the other hand, D7.I cells transfected with plasmids encoding the mutants Drp1-K38A, Drp1-S637D or Drp1-S637A indicate that the mitochondrial phenotype detected is dependent on the GTPase activity of Drp1 and the phosphorylation level of serine 637. In contrast, StarD7 silencing in the HTR-8/SVneo cell line decreases the expression of the fusion proteins Mfn1 and Mfn2 without modifying the amount of Drp1. In addition, it was observed that these cells increase the levels of ROS and present fragmented “donut” shaped mitochondria indicative of metabolic stress (Rojas et al., 2021). Changes in StarD7 levels do not modify mitochondrial morphology in the C2C12 cell line, evidenced by staining with MitoTracker Deep Red. Also, the expression of fission/fusion proteins Mfn1, Mfn2, Drp1, and PCG1α involved in mitochondrial biogenesis, were not changed. However, the observations made by electron microscopy showed, in shD7 cells, a significant disorganization in their mitochondrial crests with less expression of L-OPA1, a protein involved in their remodeling and maintenance. Finally, it was shown that the silencing of StarD7 in C2C12 cells decreases membrane potential and prevents cell differentiation to myotubes, while it increases ECAR (extracellular acidification rate), glucose uptake and the accumulation of neutral lipids. Taken together, these findings provide novel evidence indicating that alterations in StarD7 expression produce significant changes in mitochondrial morphology, dynamics, and function dependent on the cellular context. |
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| Item Description: | Trabajo realizado en: Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Bioquímica Clínica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigación en Bioquímica Clínica e Inmunología (CIBICI). |
| Physical Description: | 1 Archivo PDF : [recurso electrónico], 7,6 MB |
| Audience: | Director de tesis: Susana Genti de Raimondi. Comisión de tesis: Dras. Gabriela Borioli, Claudia Cristina Motrán y Teresa Scimonelli. Evalaudor externo: Dra. Claudia Banchio. |