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|a Resumen: En esta tesis doctoral se plantearon cinco objetivos de trabajo con la finalidad de realizar la búsqueda de nuevos nanomateriales con actividad antibacteriana en cepas resistentes a antibióticos de uso clínico. La resistencia a antimicrobianos es uno de los problemas que más impacto tiene en el sector de salud pública en la actualidad, siendo los biofilms bacterianos una de las causas de resistencia y de persistencia de numerosas infecciones, presentando hasta 1000 veces más resistencia que las bacterias en estado planctónico. Debido a esto, la búsqueda de nuevos compuestos antibacterianos, en especial aquellos capaces de erradicar biofilms preformados, es de suma importancia. El uso de nanopartículas (NP) metálicas como fotosensibilizadores en Terapia Fotodinámica Antimicrobiana (PACT) surgió como alternativa a esta problemática. El primer aspecto del estudio involucró la síntesis de nanopartículas de oro (AuNP) y plata (AgNP) conjugadas con antibiótico o con el polímero natural lignina, respectivamente (amoxi@AuNP y lignina@AgNP). La síntesis se llevó a cabo en un solo paso, aprovechando la capacidad reductora y estabilizadora de los mencionados compuestos. De esta manera, las NP obtenidas fueron estables de acuerdo a los resultados obtenidos a partir de la caracterización de las mismas mediante diferentes técnicas como espectrofotometría, microscopía electrónica de transmisión (TEM), espectroscopia infrarroja con transformada de Fourier (FT-IR), medición del potencial ζ (Zeta). La segunda etapa de trabajo se focalizó en el estudio de la actividad antibacteriana de las NP metálicas sintetizadas, utilizadas como fotosensibilizadores en la PACT, en cultivos planctónicos bacterianos de cepas clínicas resistentes de Staphylococcus aureus y Pseudomonas aeruginosa. Mediante curvas de muerte bacteriana, se obtuvo como resultado un efecto bactericida de las NP a los pocos minutos de irradiación. A su vez, se estudió el efecto fotosensibilizador de las NP en biofilms de las cepas bacterianas mencionadas anteriormente, donde se obtuvo una marcada reducción de la viabilidad celular, resultado que fue corroborado mediante técnicas como microscopía electrónica de barrido (SEM) y microscopía de escaneo láser confocal (CLSM). El tercer eje de trabajo estuvo orientado a la investigación del posible mecanismo de acción y estudio de citotoxicidad de los compuestos mencionados. La PACT se define como una reacción fotoquímica dependiente del oxígeno, que ocurre tras la activación del fotosensibilizador mediada por la luz, que conduce a la generación de especies reactivas del oxígeno (EROs) y especies reactivas del nitrógeno (ERNs). Mediante espectrofluorimetría, se observó la producción de EROs y ERNs en las cepas mencionadas anteriormente en estado planctónico, cuando las mismas fueron tratadas con las NP bajo irradiación. A su vez, la excitación de NP metálicas crea una zona de mayor temperatura en su superficie debido a la oscilación de los electrones en la superficie. Este aumento de la temperatura local conlleva a la desnaturalización de proteínas y lípidos presentes en la pared bacteriana. Por lo que la acción bactericida de las NP en la PACT en cultivos planctónicos fue el resultado de un efecto fotoquímico y fototérmico. Otro aspecto interesante fue evaluar la toxicidad en células eucariotas y la selectividad de las NP por las células bacterianas, lo que se llevó a cabo mediante ensayos de viabilidad en fibroblastos 3T3 y análisis por TEM de co-cultivos bacterianos 5 y células sanguíneas, tratados con las NP bajo irradiación. Los resultados obtenidos demostraron que las NP sintetizadas presentaron una mayor afinidad por la membrana bacteriana, a la cual se unieron en mayor proporción, de acuerdo a lo observado en las imágenes y por lo tanto demostraron ser biocompatibles. En el cuarto objetivo se llevó a cabo el diseño y caracterización de una formulación a base de hidrogel de las amoxi@AuNP para aplicación tópica. La formulación obtenida logró ser estable y con propiedades de sólido viscoelástico, sólido con propiedades adecuadas para la aplicación tópica de las NP en el tratamiento de infecciones bacterianas. El quinto eje de estudio se basó en el desarrollo de un recubrimiento con propiedades antifouling para productos médicos de base polimérica, mediante síntesis in situ de nanoplacas laminares de oro, utilizando un antibiótico aminoglucósido como agente reductor, y luego de pocos minutos de reacción, se logró la síntesis sobre la superficie del producto médico. Este recubrimiento presentó propiedades antifouling contra biofilms de cepas clínicas resistentes de S. aureus y P. aeruginosa, y una cepa de referencia de Escherichia coli, resultado observado mediante SEM. Este nuevo método facilitó la producción de nanoplacas de oro de alta pureza, aplicado directamente a la superficie deseada de forma rápida y sencilla. El revestimiento obtenido fue resistente a la erosión y al calor y confirió su capacidad antifouling al material. Mediante estos estudios pudimos obtener NP metálicas sintetizadas en un solo paso, de manera sencilla, rápida y económica, las cuales resultaron ser estables. Utilizadas como fotosensibilizadores en la PACT, presentaron actividad antibacteriana tanto en cultivos planctónicos como en biofilms de cepas bacterianas clínicas resistentes a antibióticos, optimizando el tiempo de tratamiento. Con base en los resultados obtenidos, esta terapia promete ser una alternativa terapéutica para tratar infecciones bacterianas resistentes a antibióticos, manteniendo la selectividad por células procariotas. A su vez, el desarrollo de una formulación a base de hidrogel de las NP permitiría un sistema de entrega para la aplicación local, mejorando la propiedad antibacteriana con el aumento de la concentración de NP, que podría ser alta en la zona de infección a través de la administración de la formulación. Por último, el desarrollo del recubrimiento antifouling podría aplicarse a dispositivos médicos para prevenir la formación de biofilms y extender su vida útil. Los resultados obtenidos en la tesis doctoral bajo la premisa del objetivo de encontrar compuestos para combatir la resistencia a antimicrobianos, tendría un gran impacto para la industria farmacéutica. In this doctoral thesis, four lines of work were proposed in order to search for new nanomaterials with antibacterial activity against antibiotic resistant clinical strains. Antimicrobial resistance infections due to bacterial biofilms have a major impact on public health. In fact, these biofilms cause up to 1000 times more persistent pathologies than microorganisms in planktonic state. Therefore, research for new antibacterial compounds is urgently needed, especially those capable of eradicating preformed biofilms. In this thesis, we have developed four approaches to this issue. The first aspect of the study involved the synthesis of gold (AuNP) and silver (AgNP) nanoparticles synthesized and conjugated with antibiotics or with the natural polymer lignin, respectively (amoxi@AuNP and lignin@AgNP). The synthesis was carried out in a single 6 step, taking advantage of the reducing and stabilizing capacity of the mentioned compounds. In this way, the NP obtained were stable according to the results obtained from the characterization of the NP using different techniques such as spectrophotometry, transmission electron microscopy (TEM), infrared spectroscopy with Fourier transform (FT-IR), potential measurement ζ. The second stage of work focused on the study of the antibacterial activity of the synthesized metallic NP used as photosensitizers in PACT in bacterial planktonic cultures of resistant clinical strains of Staphylococcus aureus and Pseudomonas aeruginosa. After a few minutes of irradiation, a bactericidal effect was reached. In turn, the photosensitizing effect of NP in biofilms of the mentioned bacterial strains was studied, where a marked reduction in cell viability was obtained, a result that was corroborated by techniques such as scanning electron microscopy (SEM) and scanning microscopy confocal laser (CLSM). The third approach was oriented to the investigation of the possible mechanism of action and cytotoxicity of the mentioned compounds. PACT is defined as an oxygen-dependent photochemical reaction, which occurs after light-mediated photosensitizer activation, leading to the generation of reactive oxygen species (ROS) and reactive nitrogen species (RNS). By means of spectrofluorimetry, the production of ROS and RNS was observed in the strains mentioned above in a planktonic state, after treatment with the NPs under irradiation. In turn, the excitation of metallic NP creates a zone of higher temperature on its surface due to the oscillation of electrons on the surface. This increase in local temperature leads to the denaturation of proteins and lipids present in the bacterial wall. Therefore, the bactericidal action of NP on PACT in planktonic cultures was the result of a photochemical and photothermal effect. Another interesting aspect was to evaluate the toxicity in eukaryotic cells and the selectivity of NPs for bacterial cells, which was carried out through viability assays in 3T3 fibroblasts and TEM analysis of bacterial co-cultures and blood cells treated with the NP under irradiation. The results obtained showed that the synthesized NP had a great affinity for the bacterial membrane. In the fourth approach, the design and characterization of a hydrogel-based formulation of amoxi@AuNP for topical application were carried out. The formulation obtained was stable and present properties of a viscoelastic solid, suitable for the topical application of NP in the treatment of bacterial infections. Last, we have focused on the development of an antifouling coating s for polymer-based medical products, by means of in situ synthesis of laminar gold nanoplates, using an aminoglycoside antibiotic as a reducing agent. This coating showed antifouling properties against biofilms of resistant clinical strains of S.aureus and P.aeruginosa, and the reference strain of Escherichia coli, this result was observed by SEM. This new method facilitated the production of high purity gold nanoplates, applied directly to the desired surface. The obtained coating was resistant to erosion and hea in tested times (up to 30 days), giving to the material its antifouling capacity. Through these studies, we were able to synthesize metallic NP in a single step, in a simple, fast and economic way, which turned out to be stable. Used as photosensitizers in PACT, they showed antibacterial activity both in planktonic cultures and in biofilms of antibiotic resistant clinical bacterial strains, optimizing the treatment time. Based on the results, this therapy promises to be a therapeutic alternative to treat antibiotic-resistant bacterial infections, maintaining selectivity for prokaryotic cells. In turn, the 7 development of a hydrogel-based formulation of NP would allow a delivery system for local application. Finally, the development of the antifouling coating could be applied to a wide range of medical devices to prevent the formation of biofilms and extend their useful life. The results obtained in this doctoral thesis under the premise of finding compounds to combat antimicrobial resistance, could have a positive impact for the pharmaceutical industry.
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