| Summary: | Las ribonucleasas (RNasas) T2, son enzimas endonucleolíticas presentes en todas las formas de vida celular que catalizan el clivaje de ARN de cadena simple, produciendo mononucleótidos u oligonucleótidos con un grupo fosfato (Pi) 3´ terminal. En plantas, las RNasas T2 se han dividido en 2 subfamilias de acuerdo a su filogenia y función: a) S-RNasas de clase III, de expresión específica en el pistilo e involucradas en el sistema de autoincompatibilidad (AI). Este grupo, incluye además a las non-S-RNasas y a las relic S-RNasas, estructuralmente similares a las S-RNasas pero con funciones desconocidas hasta el momento; y b) S-like-RNasas, que comprende a las S-like-RNasas clase I inducidas en distintos órganos en respuesta a una variedad de estreses bióticos y abióticos y las S-like-RNasas clase II, de expresión ubicua y constitutiva, cuya función principal es la homeostasis del metabolismo del ARN. Particularmente, en las funciones de respuesta al estrés, las RNasas contribuyen a la movilización de Pi a partir de ARN para provisión de nutrientes y energía. En este trabajo de Tesis se investigó el rol funcional y la localización subcelular de NnSR1 (Nicotiana non S-RNase1), una non-S-RNasa de clase III expresada constitutivamente en el pistilo de la especie autoincompatible Nicotiana alata. La expresión de NnSR1 se estudió al nivel de transcriptos, proteína y actividad enzimática en plantas cultivadas en un sistema de hidroponia en presencia y ausencia de Pi. Los resultados demostraron que NnSR1 es inducida selectivamente en raíz y tallo de plantas crecidas en ausencia de Pi. La inducción a nivel transcripcional fue detectada en raíz mediante RT-PCR después de 3 días de cultivo y continuó incrementándose gradualmente al menos hasta 24 días posteriores al inicio del estrés. Un anticuerpo policlonal monoespecífico, dirigido contra un péptido comercial (pNnSR1) cuya secuencia correspondía a la la región hipervariable de NnSR1, reconoció una banda de 31 kDa de peso molecular aparente en extractos de raíces y tallos crecidos en ausencia de Pi. Esta reacción cruzada de reconocimiento se inhibió casi un 80% cuando el suero se preincubó con el pNnSR1 antes de revelar el extracto de raíz. Además, el anticuerpo anti-pNnSR1 fue capaz de inhibir la actividad RNasa de la banda de 31 kDa. Concluímos que la banda de 31 kDa correspondía a NnSR1 y que ésta se induce en forma enzimáticamente activa. Este dato, sumado a la reversión de la inducción que produce el agregado de Pi al medio de cultivo, sugieren que NnSR1 es inducida para reciclar Pi a partir de ARN frente a la carencia de este macronutriente. Este resultado constituye a nuestro entender la primera evidencia experimental de un rol fisiológico específico para las non-S-RNasas. La inducción de NnSR1 fue específica de Nicotiana alata y no se verificó en otras especies de Nicotianas autocompatibles. Un fraccionamiento subcelular de extractos de raíces crecidas en ausencia de Pi, demostró que NnSR1 estaba asociada de manera casi exclusiva a la fracción microsomal. La ultracentrifugación de esta fracción en un gradiente de sacarosa reveló que NnSR1 migraba en forma paralela a la proteína BiP, marcador de retículo endoplásmico (RE). El cambio de densidad de la fracción enriquecida en membranas de RE, producida por el agregado del catión Mg2+ al gradiente de sacarosa, produjo un cambio paralelo en la migración de BiP y NnSR1. La localización de NnSR1 también fue estudiada mediante microscopía confocal de fluorescencia. La región codificante del gen NnSR1 fue expresada de manera transiente, conjugada a la proteína fluorescente Cerulean protein (CerFP), en protoplastos de hoja de Arabidopsis y en hojas de Nicotiana benthamiana. En ambos sistemas, la proteína de fusión NnSR1-CerFP colocalizó con el marcador de RE HDEL-YFP. Tomados en conjunto estos resultados indican que NnSR1 reside en compartimentos de RE. Este dato es novedoso, ya que las RNasas de clase III descriptas hasta el momento están localizadas exclusivamente en la matriz extracelular del tejido de transmisión del pistilo. Un análisis comparativo de la expresión en condiciones de déficit de Pi en Nicotiana alata demostró que las únicas RNasas T2 inducibles en estas condiciones son NnSR1 y NE, una S-like RNasa extracelular de clase I. La inducción de NnSR1 ocurre antes que la de NE, sugiriendo que el ARN endógeno, principal fuente de reserva intracelular de Pi, es utilizado antes que el ARN extracelular.
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