Estudio sobre los mecanismos de acilación y transporte intracelular de proteínas periféricas aciladas /
La unión covalente de palmitato, u otros ácidos grasos, a residuos de cisteína a través de enlaces tioéster (S-acilación), es una modificación postraduccional reversible que tiene diferentes consecuencias sobre la proteína modificada. Dicha lipiclación está catli7ada por las enzimas acil-transferasa...
| Main Author: | |
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| Other Authors: | , , , , |
| Format: | Thesis Book |
| Language: | Spanish |
| Published: |
Córdoba :
[s. n.],
2016
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| Subjects: |
| Summary: | La unión covalente de palmitato, u otros ácidos grasos, a residuos de cisteína a través de enlaces tioéster (S-acilación), es una modificación postraduccional reversible que tiene diferentes consecuencias sobre la proteína modificada. Dicha lipiclación está catli7ada por las enzimas acil-transferasas o PATs (del inglés Protein Afy1tran.'ferases), mientras que la deacilación involucra la actividad de las enzimas tioesterasas o APTs (del inglés 4y1-Protein Thioesterases). La manipulación farmacológica de esta modificación ha avanzado en los últimos tiempos gracias al desarrollo de diversos inhibidores principalmente de la deacilación, aunque también de la acilación. La utilización de los mismos permite un mayor entendimiento del proceso mediante el cual ocurre la palmitoilación y la importancia de su dinamismo y reversibilidad. Entre ellos el 2-bromopalmitato (2-BP), un análogo no metabolizable del ácido palmítico, es el más ampliamente utilizado para inhibir las PATs. Sin embargo, observaciones previas de nuestro laboratorio sugirieron que 2-BP podría afectar también el proceso de deacilación. En este trabajo investigamos el efecto de dicho compuesto, tanto in vivo como in ttiv, sobre la deacilación de la proteína GAP-43 y, más específicamente, sobre la actividad de APTI y APT2. En base a los resultados aquí presentados, y como la actividad enzimática de las APTs se vio inhibida por el tratamiento con 2-BP afectando los cielos de acilación/deacilación de la proteína estudiada, sugerimos que los análisis cinéticos y la interpretación de los resultados obtenidos mediante el uso de este inhibidor, deberían ser cuidadosamente revisados. Sin embargo, condiciones experimentales controladas utilizando 2-BP, pueden resultar útiles para detener el recambio de palmitato en proteínas palmitoiladas. Esto podría permitir el estudio de la importancia del proceso de deacilación en la función de dichas proteínas. Por otra parte, estudiamos el rol de la deacilación y de las tioesterasas sobre la localización intracelular dinámica de la proteína H-Ras, ya que la correcta distribución de dicha proteína es un aspecto fundamental en la biología de la misma. De esta manera, describimos los distintos procesos y la cinética mediante los cuales H-Ras es movilizada entre las diferentes organelas, y la interconexión existente entre ellas. A pesar de que se observaron notorias diferencias en cuanto a la localización subcelular de las variantes di y monoaciladas, demostrando la importancia de la estequiometria y la posición de los palmitatos, todas resultaron funcionales siendo capaces de activar la vía de señalización de Erkl /2. Además, demostramos que la deacilación de H-Ras monoadiladas se ve incrementada en células que sobreexpresan tanto APTI como APT2, modificando su localización subcelular. La versión salvaje, sin embargo, no mostró modificaciones en la escala de tiempo analizada, probablemente debido a un proceso de deacilación más lento. Por último, demostramos que tanto mecanismos de transporte vesicular como de difusión, están involucrados en el tráfico retrógrado de H-Ras desde membrana plasmática, realizando un aporte a los modelos establecidos previamente para el transporte intracelular de esta proteína. En conclusión, este trabajo destaca la importancia de la modificación por S-adilación y su dinámica sobre distintos aspectos estudiados en dos proteínas periféricas modelo (GAP- 43 y H-Ras). La modulación de la actividad de las enzimas involucradas en la palmitoilación (en este caso en particular, las tioesterasas) resulta relevante para determinar la dinámica del tráfico intracelular y la localización subcelular apropiada, pudiendo afectar, en consecuencia, la función de las proteínas modificadas. The covalent attacbment of a palmitate, or other fatty acids, to a cysteine residue through a thioester bond (S-acylation), is a post-translational and reversible modification that has different consequences on the modified protein. This lipidation is catalyzed by Protein Acyltransferases (PATs), while deacylation involves the activity of Acyl-Protein Thioesterases (APTs). The pharmacological manipulation of this modification has advanced in the later years due to the development of different inhibitors of both acylation and deacylation, being more significant in the latter case. The use of these inhibitors aliows a greater understanding of the palmitoylation process and the importance of its dynamism and reversibility. Among them, 2-bromopalmitate (2-BP), a non-metabolizable analog of palmitic acid, is commonly used to inbibit PATs activity. However, previous observ-ations from our laboratory suggested that 2- BP can also affect the deacylation step. In this work we investigated the effect of this compound, both in sito and in ttm, on the deacylation of GAP-43 and, more specifically, on APTI and APT2 function. We concluded that the enzymatic activity of APTs was inhibited with 2-111) treatment affecting acylation/deacylation cydes of the studied protein. In consequence, we suggest that previous reports on palmitoylation kinetics using this inhibitor should be carefully analyzed. Nevertheless, controlled experimental conditions using 2-13P could be still useful to stop the palmitate turnover of S-acylated proteins. This can allow the study of the importance of deacylation process in the function of diese proteins. We also studied the role of deacylation and thioesterases on the dynamic intracellular localization of H-Ras, due to the relevance of dic correct distribution of the protein in the biology of Ras. ThUS, we described the different processes and kinetics involved in the trafficking of H-Ras through the organelles, and the interconnection between them. In spite of dic notorious differences in dic subcellular localization of di and monoacylated variants, which demonstrate the importance of the stoichiometry and the position of the palmitates, all of them were functional and capable of activating Erkl /2 signa]ing pathWay. Moreover, we observed that monoacylated H-Ras deacylation is enhanced in cdlls that overexpress either APTI or APT2, modifying their subcellular localization. The wild type protein, however, did not show any modification on its location in the scale of time analyzed, probably due to a slower deacylation process. Finaily, ve demonstrated that both vesicular transport as WC11 as diffusion are involved in the retrograde trafficking of H-Ras from dic plasma membrane, making an important contribution to dic previously established modeis describing the intracelular transport of this protein. In conclusion, this work highlights the importance of S-acylation and its dynamics on the different aspects described for the peripheral model proteins studied. The modulation of the enzymes activity that regulate palmitoylation (particularly the thioesterases) is relevant in determining the dynamics of intracellular trafficking and the appropriate subcellular localization and might affect, in consequence, the function of the modified proteins. |
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| Item Description: | Director de tesis: Dr. José Luis Daniotti. Comisión de tesis: Dres. Javier E. Valdez, Gustavo A. Chiabrando, Alfredo Lorenzo. Evaluador externo: Dra. María Elena Teresa Damiani Trabajo realizado en: Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Químicas. Departamento de Química Biológica. Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba (CIQUIBIC). |
| Physical Description: | x, 114 p. : il. col. ; 30 cm. + 1 Archivo PDF : [recurso electrónico], 6,8 MB |