| Summary: | Esta tesis se focalizó en la caracterización estructural de liposomas conteniendo componentes de interés biológico como colesterol y la ceramida y su interacción con moléculas anfifílicas de interés farmacológico, como lo son los alquil ésteres del ácido L-Ascórbico con distintos largos de su cadena hidrocarbonada. En una primera etapa investigamos las propiedades estructurales y reológicas de membranas modelos que contienen 1-palmitoil 2-oleoil fosfatidilcolina y sus modificaciones en presencia de colesterol y ceramida. Estos lípidos han sido objeto de renovado interés desde que se propusiera la existencia de entidades lípido-proteicas, bautizadas como “rafts” o balsas lipídicas ricas en esteroles y esfingolípidos como centros de alta actividad de enzimas involucradas en transducción de señales celulares. Se analizó la estructura adquirida de dispersiones lipídicas de composiciones binarias y ternarias de 1-palmitoil 2-oleoil fosfatidilcolina, colesterol y ceramida, sobre la base de los estudios previos. Sometimos las dispersiones lipídicas a estudios estructurales para determinar la distribución de tamaño de las vesículas formadas. A pesar de que las vesículas fueron forzadas a adoptar estructuras pequeñas al ser extruidas por un filtro de policarbonato con poros de 100 nm en algunos casos no se obtuvieron poblaciones con una distribución de tamaño homogénea. Los resultados logrados sugieren que la presencia de colesterol y ceramida inducen reestructuración de las bicapas estudiadas. En particular las mezclas que presentan coexistencia de fase Líquido desordenada - Líquido ordenada, y Líquido desordenada - Gel mostraron la presencia de estructuras más grandes, probablemente debido a fenómenos de agregación. Esta hipótesis fue confirmada por estudios de dispersión de rayos X de bajo ángulo. El análisis mostró que la mitad de las estructuras corresponden a bicapas interaccionando con regularidad estructural, lo cual se correlaciona con fenómenos de aposición y agregación parcial de las vesículas. La heterogeneidad observada en las 4 poblaciones con bajo contenido de 1-palmitoil 2-oleoil fosfatidilcolina puede deberse a que los lípidos no se distribuyeron homogéneamente en las vesículas produciendo variaciones de composición entre las distintas poblaciones. Adicionalmente a los estudios estructurales de las vesículas lipídicas, nos interesó evaluar la estabilidad de estas estructuras con respecto a algún perturbante de membrana. El agente elegido fue el detergente no iónico Tritón X-100 que en concentraciones sublíticas induce la pérdida del contenido acuoso en vesículas de 1-palmitoil 2-oleoil fosfatidilcolina. La presencia de colesterol introdujo una protección de la membrana al efecto del detergente proporcional a su contenido, el cual fue contrarrestado proporcionalmente por la presencia de ceramida. Esto puede deberse a que colesterol induce cambios de las propiedades reológicas de las membranas produciendo la aparición de la fase Líquido ordenada, con una estructura más compacta y resistente. Por otro lado la presencia de ceramida induce la formación de dominios en estado Gel que forman interfaces laterales peridominio) entre esta fase rígida y una fluida, lo que tiene la potencialidad de favorecer los defectos laterales y permitir la salida de componentes del compartimiento intravesicular. En nuestros estudios utilizamos el detergente Tritón X-100 como agente desestabilizante, pero en un entorno biológico dicho desestabilizante puede ser cualquier molécula anfitrópica natural, como es el caso de otros actores en la señalización celular, o sintética como distintos fármacos anfifílicos con capacidad de integrarse y cambiar las propiedades fisicoquímicas de las membranas lipídicas. En este contexto, en una segunda etapa del desarrollo de esta tesis, focalizamos nuestra atención al efecto que tiene sobre las membranas biológicas la incorporación de fármacos de la familia de los alquil ésteres del ácido L-ascórbico. Se pretendió profundizar en el entendimiento de los mecanismos de acción de los fármacos en estudio y el efecto del largo de su cadena hidrocarbonada. Se estudió el eventual efecto solubilizante del laurato de ascorbilo, miristato de ascorbilo y palmitato de ascorbilo en liposoma multilamelares de 1-palmitoil 2- 5 oleoil fosfatidilcolina. En ninguno de estos casos se observaron que fueran capaces de solubilizar los sistemas lipídicos en estudio. Seguimos investigando otros fenómenos que pudieran producir los alquil ésteres del ácido L-ascorbico sobre las membranas y que evidencien su integración a los agregados lipídicos. Al enfrentar vesículas lipídicas de 1-palmitoil 2-oleoil fosfatidilcolina con suspensiones de alquil ésteres del ácido L-ascórbico observamos cambios en la distribución del tamaño de vesículas y reestructuración de las membranas con aparición de poblaciones grandes, que evidencian la integración de los alquil ésteres del ácido L-ascórbico a las vesículas y que resultó dependiente de la longitud de la cadena alquílica de los fármacos. Estos resultados nos condujeron a evaluar la integridad de la membrana y / o la formación de poros concomitante a la reestructuración de la membrana inducida por los alquil ésteres del ácido L-ascórbico. Por esta razón, se realizaron ensayos de liberación de carboxifluoresceína desde el compartimento intravesicular tras la adición de los alquil ésteres del ácido L-ascórbico. Sólo el miristato de ascorbilo indujo una liberación significativa de contenido. Este resultado inesperado revela que la capacidad de alteración de la membrana o formación de poros no es lineal con la longitud de la cadena alquílica de los alquil ésteres del ácido L-ascórbico, y que probablemente dependa de efectos concertados y complementarios, relacionados a las diferentes propiedades de los agregados de alquil ésteres del ácido L-ascórbico y a las distintas propiedades reológicas de las membranas producidas por la inserción de los fármacos. Se estudiaron cambios en las propiedades de membrana inducidos por los alquil esteres de ácido L-ascórbico en hidratación de la superficie y en la microviscosidad del ambiente hidrofóbico de la membrana. Mediante mediciones fluorimétricas de la polarización generalizada del Laurdan y de la anisotropía de fluorescencia del difenil hexatrieno. El miristato de ascorbilo resultó ser el modulador más eficiente de ambos parámetros, seguido por el laurato de ascorbilo en el caso de la hidratación de superficie o por el palmitato de ascorbilo en las 6 mediciones de la microviscosidad de la membrana. El considerable aumento de la polarización generalizada del Laurdan y el pobre efecto que tiene en la anisotropía la incorporación del laurato de ascorbilo puede reflejar una inserción más superficial de este fármaco en la bicapa. Por otro lado el comportamiento del palmitato de ascorbilo puede estar relacionado con la tendencia de este compuesto a segregarse lateralmente en dominios de tipo geles enriquecidos en el fármaco, previamente observados en sistemas de monocapa lipídica. Para una visualización directa y en tiempo real de los efectos de los alquil esteres del ácido L-ascórbico, utilizamos vesículas unilamelares gigantes y las observamos por microscopia confocal de fluorescencia. La adición de alquil ésteres del ácido L-ascórbico a las vesículas indujo una disminución de tensión de la membrana en diferente medida en todos los sistemas estudiados, la cual se evidencia por las deformaciones de las membranas y desestabilización de su integridad con liberación de contenido intravesicular. En este sentido, el miristato de ascorbilo resultó ser el compuesto más activo, induciendo el estiramiento de las vesículas en la dirección del flujo del medio. El laurato de ascorbilo mostró un comportamiento similar, pero de manera moderada mientras que el palmitato de ascorbilo solamente indujo un aumento en la rugosidad de la membrana. Además el palmitato de ascorbilo indujo la segregación de dominios de fase Gel enriquecido en el fármaco. Estos experimentos de microscopía confocal también mostraron una disminución notable de la intensidad de fluorescencia causada por reducción química del grupo rodamina del fluoróforo utilizado. Esta pérdida de fluorescencia no fue reproducida por el ácido ascórbico soluble, lo cual indicaría su inserción en las membranas para que puedan ejercer su función antioxidante. Considerando que los tres compuestos tienen una capacidad reductora similar, estos cambios pueden estar directamente relacionados a la capacidad de inserción de cada uno de ellos. La información bibliográfica revela que los derivados alquílicos del ácido L-ascórbico que poseen cadenas alquílicas de distintos largos utilizados en diferentes preparaciones farmacológicas tienen sutiles diferencias en la eficacia terapéutica. 7 Estas diferencias pueden estar relacionadas a las diferentes interacciones de los alquil ésteres del ácido L-ascórbico con las membranas celulares. La diferente actividad encontrada para cada uno de ellos en el presente trabajo puede dar cuenta de un potencial uso farmacológico característico de cada derivado, y contribuir al diseño de nuevas aplicaciones que tengan interfaces biológicas como destino principal.
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