| Summary: | ZEB1 es un factor de transcripción (ET) involucrado en la diferenciación mesodérmica y la transición epitelial-mesenquimatosa (EMT) en cáncer, el cual se expresa como dos isoformas fosforiladas. La pérdida de CCN6, una proteína moduladora de la vía del factor de crecimiento insulino-símil tipo 1 (IGF- 1), dispara la EMT y la expresión de ZEB1 en células mamarias epiteliales humanas (HME). Sin embargo, los roles de la fosforilación y la vía de señalamiento CCN6-IGF-1 en la regulación la actividad biológica de ZEB1, son desconocidos. Ensayos de cambio en la movilidad electroforética y estudios de genes reporteros probaron que la disminución en la fosforilación de ZEB1 incrementa la unión y la represión transcripcional de ZEB1 por sus genes blanco. Análisis funcionales con mutantes no fosforilables mostraron que la fosforilación por PMA/lonomicina (activador de PKC) o IGF-1 previenen la represión transcripcional por ZEB1. La inmunoprecipitación en lisado de células CHO-K1 reportó a ZEB1 como una proteína de interacción de MEK/ERK1-2. Incubaciones con inhibidores/activadores de vías de señalización bioquímicas probaron que la fosforilación de la T867 en ZEB1 por IGF-1/MEK-ERK bloquea su localización nuclear y actividad transcripcional. En un modelo tumoral, la proteína recombinante CCN6 (rhCCN6) fue suficiente para disminuir los niveles de ZEB1 en células HME con deficiencia en CCN6 (CCN6 KD) y MDA-MB-231 de cáncer de mama, disminuyendo su capacidad invasiva y proliferativa. La carencia de CCN6 indujo la secreción de IGF-1 por las células HME; efecto revertido por la adición de rhCCN6. La inhibición del receptor de IGF-1 (IGF-1R) demostró que la sobreexpresión de ZEB1 por pérdida de CCN6 requiere de la activación de la vía dependiente del GE-1R. rhCCN6 también inhibió la expresión de ZEB1 inducida por IGF-1 en células MIDA-MB-231. En muestras de carcinomas mamarios invasivos, la concomitante pérdida de CCN6 con la elevada sobreexpresión de IGF-1 ARNm correlaciona con inmunopositividad de FTs EMT-relacionados, ZEB1 o Snaii (test exacto de Fisher, p= 0,0114). Estos resultados permitieron identificar i) sitios de fosforilación clave en ZEB1, blanco de la vía MEK/ERK y, ji) una nueva vía reguladora, dependiente de IGF-1, a través de la que CCN6 actúa para limitar la expresión de ZEB1, la EMT y la progresión en cáncer de mama. PALABRAS CLAVE: ZEB1, dominio carboxilo-terminal, vías de señalización, fosforilación, células epiteliales de ovario, células epiteliales de mama, transición epitelial-mesenquimatosa, cáncer de mama. xi ZEB1 is a transcription factor (TE) involved in the mesoderm differentiation and the epithelial-tomesenchymal transition (EMT) in cancer; which is expressed as two phosphorylated isoforms. Knockdown of CCN6, a protein modulating the insulin-Iike growth factor-1 (IGE-1) pathway, triggers EMT with upregulation of ZEB1 in human mammary epithelial celis (HME). However, the roles of phosphorylation and the CCN6-IGF-1 signaling in the regulation of ZEB1 biological activity are unknown. Electrophoretic mobility shift assay and gene reporter studies proved that a decrease in ZEB1 phosphorylation increase both DNA binding and transcriptional repression of ZEB1 target genes. Eunctional analysis of non-phosphorylatable mutants show that phosphorylation by PMA/ionomycin (PKC activator), or by IGF-1, can prevent the transcriptional repression by ZEB1. lmmunoprecipitation using a CHO-K1 celI lysate reported that ZEB1 is an interacting protein of MEK/ERK1-2. lncubations with activators and inhibitors of signaling pathways showed that IGF-1/MEK-ERK phosphorylation of a T867 of ZEB1 disrupted its nuclear localization and transcriptional activity. In a cancer model, human recombinant CCN6 (rhCCN6) protein was sufficient to downregulate ZEB1 levels in CCN6-deficient (CCN6 KD) HME celis and MDA-MB-231 breast cancer celis, decreasing invasion and proliferation. Kriockdown of CCN6 induced IGF-1 secretion in HME celis; this effect was reverted by rhCCN6 addition. Inhibition of the IGF-1 receptor (IGF-1R) revealed that ZEB1 upregulation due to CCN6 loss requires activation of IGE-1R signaling. rhCCN6 blunted IGF-1-induced ZEB1 upregulation in MDA-MB-231 celis. In invasive breast carcinoma samples, the concomitant loss of CCN6 and upregulation of IGF-1R mRNA levels is associated with EMT-TEs, ZEB1 or Snail, immunopositivity (Fisher's exact, p= 0.0114). These results identified that 1) ZEB1 harbors key phosphorylation sites which are likely targets of MEK/ERK pathway and, ji) the IGE-1 signaling is a novel modifier through which CCN6 acts limiting ZEB1 expression, EMT and breast cancer progression.
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