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Determinantes moleculares de la concentración diferencial de las glicosiltransferasas de glicolípidos en subcompartimentos del complejo de Golgi /
La síntesis de glicolípidos complejos es catalizada por diferentes glicosiltransferasas residentes del complejo de Golgi. La mayoría de ellas son proteínas de membrana tipo II y están compuestas por un dominio COO-terminal luminal unido a un dominio NH2-terminal (Ntd) constituido por un tallo cit...
La síntesis de glicolípidos complejos es catalizada por diferentes glicosiltransferasas residentes del complejo de Golgi. La mayoría de ellas son proteínas de membrana tipo II y están compuestas por un dominio COO-terminal luminal unido a un dominio NH2-terminal (Ntd) constituido por un tallo citoplasmático corto (CT) y una región transmembrana (TMR). Estas enzimas se organizan como complejos multienzimáticos y se concentran de manera selectiva en diferentes compartimentos sub-Golgi, superponiéndose y actuando sucesivamente en la adición de azúcares a glicolípidos aceptores. Los Ntds son capaces de localizar glicosiltransferasas en el complejo de Golgi, pero todavía no se conoce bien si además pueden conferirles concentración selectiva en diferentes compartimentos sub-Golgi. En este trabajo se estudió si los Ntds de Sia1T2, localizada en el Golgi proximal (cis, medio y trans), y de GaINAcT, que se concentra en trans GolgilTGN, concentran proteínas reporteras (YFP y CFP) en los compartimentos sub-Golgi correspondientes. La concentración sub-Golgi de los Ntds fusionados a variantes espectrales de GFP fue determinada en células CHO-K1 a partir de su comportamiento frente al agregado de brefeldina A (BFA). Microscopía de fluorescencia y fraccionamiento subcelular mostraron que el Ntd de SialT2 se concentra en un compartimento proximal del complejo de Golgi, y el de GalNAcT en elementos del TGN. El intercambio de TMR y CT entre SialT2 y GalNAcT indicó que la información para la concentración en Golgi distal o proximal está asociada a los CTs. Por otra parte, conociendo la existencia de un complejo formado por GaIT1, SialT1 y Sia1T2, se investigó si en células CHO-K1 que no expresan Sia1T2, la sublocalización de GalT1 y SialT1 era afectada cuando se coexpresaba Sia1T2. Experimentos previos del laboratorio habían mostrado que la síntesis de glicolípidos era afectada en forma diferente en células CHO-K1 silvestres (wt) y células CHO-K1 que expresan SialT2 (SiaIT2+). Se encontró que BFA y monensina impiden la síntesis de glicolípidos posteriores al gangliósido GM3 en células wt, pero en células Sia1T2+ esto ocurre más allá de GlcCer. Considerando la posibilidad de que la expresión de SialT2 estuviese modificando la localización sub-Golgi de GalT1 y SialT1 se determinó la localización sub-Golgi de las quimeras GaITh52-CFP y SiaIT11_54-YFP por microscopía de fluorescencia y por subfraccionamiento isopícnico. Mientras que BFA redistribuyó GaIT1-CFP y SiaIT1-YFP al RE en células wt, en células Sia1T2+ una fracción de estas quimeras permaneció asociada a compartimentos del Golgi distal, enriquecidos en marcadores de TGN y endosomas de reciclado. En células tratadas con BFA el porcentaje de GaIT1-CFP y SiaIT1-YFP asociadas a fracciones de membrana tipo Golgi separadas por subfraccionamiento isopícnico fue mayor en 5 Resumen células Sia1T2+ que en células wt. Estos efectos fueron revertidos anulando la expresión de SialT2 con siRNA específico. Los resultados indicaron que la localización sub-Golgi de complejos de glicosiltransferasas puede cambiar de acuerdo a los niveles relativos de expresión de las enzimas participantes y revelaron la capacidad de esta organela para adaptar la topología de la maquinaria de síntesis de glicolípidos a diferentes estados funcionales de la célula.
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Trabajo realizado en: CIQUIBIC - CONICET. Centro de Investigaciones en Química Biológica de Córdoba. Departamento de Química Biológica. Facultad de Ciencias Químicas. Universidad Nacional de Córdoba
