| Summary: | La a2-Macroglobulina (c 2-M) humana es un inhibidor de proteinasas de amplio espectro que cumple una función preponderante en el proceso inflamatorio al inhibir la actividad proteolítica de proteinasas involucradas en la remodelación de la matriz extracelular, tales como el activador tisular del plasminógeno, plasmina y las metaloproteinasas de matriz extracelular M1MIP-2 y MItvlP-9. La a2-M inhibe proteinasas mediante un mecanismo de "atrapamiento molecular", seguido por un proceso de endocitosis y degradación lisosomal mediado por el receptor LRP-1 que está expresado en células del sistema inmunocompetente, incluido macrófagos. Aunque LRP-1 es definido como un receptor endocítico, ha sido propuesto que participa en diversos eventos de transducción de señales involucrados con la proliferación y migración celular. Por ende, el principal objetivo de este trabajo de tesis fue demostrar que la a2-M activada por proteinasas (a2_M*), adquiere la propiedad bioquímica de regular el componente celular inflamatorio mediado por la interacción con el receptor LRP- 1. A su vez, como es conocida la capacidad de LRP- 1 para asociarse con diversas proteinas adaptadoras intracelulares y receptores de la membrana plasmática celular, también se propuso investigar las vías intracelulares de señalamiento generadas a partir de la interacción con a2M*. Para el cumplimiento de estos objetivos, y dada la complejidad y diversidad del componente celular inflamatorio, en este trabajo se utilizó un modelo experimental basado en líneas celulares derivadas de macrófagos que expresan en forma constitutiva LRP- 1 sobre la superficie de la membrana plasmática celular. En una primera etapa se evaluó el efecto de a2M* sobre la proliferación de la línea celular J774 derivada de macrófagos a través de ensayos de incorporación de timidina-H3. Los resultados evidenciaron que a2-M incrementó la incorporación de timidina, lo cual fue inhibido por el antagonista del receptor LRP-1, RAP. Del mismo modo cuando se utilizó una línea celular carente de LRP-1, la a2M* fue incapaz de modificar la incorporación de timidina. Por lo tanto, se concluyó que el efecto proliferativo de a2_M* sobre la línea celular J774 es mediada por LRP- 1. En una segunda etapa experimental se estudió, en estas mismas células, sí el efecto proliferativo de a2M* involucraba la movilización de calcio intracelular ([Ca2 ]). Para ello, se emplearon técnicas de espectrofluorometria en células cargadas con el fluorósforo para calcio FURA-2/AM. Los resultados obtenidos demostraron que: i) a2M* incrementó los niveles de [Ca2'li en la línea celular J774 de manera dependiente de la concentración de ligando; u) el incremento fue tanto a expensas de la liberación de calcio contenido en depósitos del retículo endoplásmico, así como del influjo de calcio extracelular a través de la apertura de canales jónicos; y iii) lactoferrina., un ligando de LRP-1, incrementó los niveles de [Ca2'li con una cinética similar a la observada para a2M*. Además, el efecto de la ct2M* sobre la movilización de [Ca 211,fue completamente inhibida en la línea celular J774 tratada con LPS, un regulador negativo de la expresión de LRP-1. Considerando en conjunto los resultados, se concluyó que a2M* al interaccionar con LRP- 1 promueve la movilización [Ca 24], el cual es un segundo mensajero vinculado con los eventos de proliferación celular. Finalmente, en la tercera etapa se investigó si el efecto proliferativo de a2_M* en la línea celular J774 involucraba a la vía de las MAPK, evaluando para ello la fosforilación de ERK-1 y ERK-2 por técnicas de Western biot. Los resultados indicaron que la interacción de a2M* con LRP- 1 efectivamente desencadenó la fosforilación de ERK-1 y ERK-2. Considerando los resultados en conjunto se concluye que la forma activada de a2-M induce proliferación de la línea celular derivada de macrófagos J774 al interaccionar con el receptor LRP- 1, lo cual a su vez genera señalamiento intracelular caracterizado por la movilización de calcio y la activación de las MAPKs ERK-1 y ERK-2. En el mismo sentido, también podría ser concluido que a2M*, además de inhibir proteinasas de la inflamación, actúa como un regulador de la activación de macrófagos durante el proceso inflamatorio.
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