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|a Introducción: Las Lipofuscinosis Ceroideas Neuronales (LCN n un grupo de patologías degenerativas progresivas del cerebro y la retina en asociación con depósitos intracelulares de material caracterizado morfológicamente como lipofuscina-ceroide. Se reconocen por una combinación de síntomas característicos: falla visual, convulsiones, deterioro intelectual, malfunción motora, mioclonías, demencia y muerte temprana. Pueden tener su inicio a cualquier edad, predominando en la infancia y la juventud. Se las clasifica dentro de las Patologías de Almacenamiento Lisosomal. La herencia es generalmente autosómica recesiva a excepción de una forma adulta autosómica dominante. La clasificación contempla 14 formas diferentes con 14 genes, 402 mutaciones y 67 polimorfismos registrados. La prevalencia estimada de LCN a nivel mundial varía desde 1:1.000.000 en algunas regiones a 1:100.000 en los países escandinavos. En Latinoamérica (LA) no se habían descripto pacientes de los tipos CLN3, CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8, los cuales carecen de marcadores bioquímicos específicos. Objetivo: Estudiar la heterogeneidad morfológica, bioquímica y molecular de las LCN tipos CLN3, CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8 en la población de LA con fenotipos de edad de inicio juvenil e infantil tardía. Sujetos: n = 156 familias ingresadas al Programa Integral de Detección de LCN del CEMECO, Hospital de Niños de la Provincia de Córdoba, Argentina. Métodos: a) Aplicación de la estrategia diagnóstica acordada en consensos internacionales; b) Estudios morfológicos con microscopía óptica (MO) y con microscopía electrónica de transmisión (MET) en tejidos de pacientes; c) Análisis del ADN genómico de los individuos afectados y sus familiares por PCR y secuenciación; d) Corroboración de cambios de secuencia en el ADN y mutaciones por secuenciación directa en una nueva muestra de DNA del paciente o utilizando enzimas de restricción; e) Validación de los cambios de sentido e intrónicos por estudios de co-segregación intrafamiliar, con herramientas bioinformáticos y por verificación de la ausencia del cambio de secuencia en 200 alelos control. Resultados: a) Se definió una población de n = 139 pacientes sin deficiencias enzimáticas de TPP1 o PPT1; b) Se analizaron n = 56 biopsias de piel, músculo y/o linfocitos por MO y MET; c) Se identificaron linfocitos vacuolados por MO en 8 pacientes; d) Los morfotipos clásicos y variantes de las se describieron para n = 47 pacientes; e) Se reconocieron los depósitos característicos tipo lipofuscina-ceroide de diferente patrón ultraestructural: cuerpos curvilíneos y/o cuerpos en huella digital solos o combinados en 13 pacientes; f) No se visualizaron en ningún paciente depósitos intracelulares de patrón ultraestructural granular osmiofílico; g) Se identificaron, corroboraron y registraron 10 cambios de secuencia nuevos y 2 conocidos en los exones y las regiones intrónicas flanqueantes de los genes CLN3, CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8; h) La presencia de la deleción más frecuente c. 461-280- 677+382del966(e6-7) en el gen CLN3 fue confirmada en 5 pacientes, 3 en homocigosis y 2 en heterocigosis, en 8 de los 12 alelos (66,67%); i) Las mutaciones del gen CLN3: c.400T>C=p.C134R (e6) y c.1197 G>T = p.E399X (e14) se describen, analizan y registran por primera vez; j) Las mutaciones del gen CLN5: c.291 insC = p.S98fs(e1) y c.1002-1006 del AACA = p.K368SfsX15(e4) se describen en dos pacientes en homocigosis y se registran por primera vez; k) El carácter polimórfico del cambio de secuencia en el gen CLN5 c.4C>T (e1) = p.R2C se confirma en 3/96 alelos en una población control de composición étnica semejante latinoamericana con una frecuencia relativa de 0,031; l) Se detectaron polimorfismos conocidos en los genes CLN5, CLN6 y CLN7; m) En dos pacientes argentinos se describen cuatro cambios nuevos en el gen CLN6: p.R103W (e4), p.P184LfsX17 (e6), p.R252H (e7), c.486+8C>T (e/i4) en heterocigosis. Los dos pacientes presentan el polimorfismo c.198+104T>C rs8025947; n) Tres pacientes presentaron cambios de secuencia en el gen CLN7, 2 conocidos y un cambio nuevo c.63-4del C (i2); ñ) Dos pacientes presentaron el mismo cambio nuevo en el gen CLN8: c.685C>G = p.P229A en homocigosis en el exón 3; o) Cuatro cambios nuevos (nsSNP) fueron analizados con al menos cuatro herramientas bioinformáticas diferentes para predecir su patogenicidad, siendo evaluados dos como probablemente patogénicos y dos como probablemente benignos o neutrales. Discusión y Conclusiones: 1) La metodología de análisis con utilización de algoritmos acordados en los consensos internacionales se adecuó al Programa de Detección de las LCN y su aplicación sistemática permitió disminuir la falta de reconocimiento de estas afecciones en la región estudiada. Se amplió el área geográfica de los genes estudiados y hallados por primera vez en la Región. La heterogeneidad de la población de LA y su ascendencia europea probablemente se vinculan a la aparición de mutaciones conocidas en el Hemisferio Norte y nuevas mutaciones atribuibles a la población autóctonas; 2) Se reconocieron por primera vez en LA los genotipos CLN3, CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8; 3) La validación de los genotipos moleculares con herramientas bioinformáticas aportó resultados confluentes para interpretar el carácter patológico de las mutaciones nuevas de cambio de sentido; 4) La genética molecular de las LCN ha resultado más compleja que lo que se suponía inicialmente cuando se describieron los primeros cuatro genes en la década de los noventa; 5) En 6 pacientes se detectó la presencia de mutaciones y/o polimorfismos en más de un gen lo que hace sospechar que existe una red compleja de relaciones que condicionan la presentación y progresión de los síntomas; 6) En más del 50 % de los pacientes ingresados al Programa de Detección de las LCN de CEMECO se identificó un morfotipo positivo sin encontrarse cambios en las regiones codantes y las regiones intrónicas flanqueantes estudiadas. Estos pacientes son evaluados para participar en la búsqueda de nuevos genes en colaboración con consorcios internacionales. Los desafíos a afrontar son numerosos debido a la complejidad las patologías LCN, siendo el campo de mayor demanda social el de desarrollo de estrategias terapéuticas, que requiere como base la caracterización integral de los pacientes. Este Trabajo de Tesis realizada en el marco del Programa de Detección de las LCN del CEMECO-Hospital de Niños de la Santísima Trinidad de la Provincia de Córdoba constituye un aporte en tal sentido.
|b SUMMARY: Introduction: The neuronal ceroid lipofuscinoses (NCLs) are a group of progressive degenerative diseases of the brain and the retina, associated with an intracellular accumulation of material morphologically characterized as ceroid/lipofuscin-like. They are recognized by a combination of characteristic symptoms: visual failure, seizures, intellectual impairment, motor dysfunction, myoclonus, dementia and early death. Onset may occur at any age, and childhood and juvenile onset is predominant. NCLs are classified as lysosomal storage diseases. Inheritance is generally autosomal recessive, except for a dominant autosomal adult form. The classification includes 14 different forms, with 14 genes, 402 mutations y 67 polymorphisms recognized to date. The estimated global prevalence of NCLs ranges from 1:1,000,000 in some regions to 1:100,000 in Scandinavia. Patients with the CLN3, CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8 types, which lack specific biochemical markers, had not been described in Latin America (LA). Purpose: To study the morphological, biochemical and molecular heterogeneity of type CLN3, CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8 NCLs in the LA population with phenotypes of juvenile and late childhood onset. Subjects: n=156 families enrolled in the Comprehensive NCL Screening Program, CEMECO, Province of Cordoba Children's Hospital, Argentina. Methods: (a) Application of the diagnostic strategy agreed on by international consensus; (b) Morphological studies using light microscopy (LM) and transmission electron microscopy (TEM) on patients' tissues; (c) Genomic DNA analysis of the affected individuals and their relatives by PCR y sequencing; (d) Corroboration of DNA sequence changes and mutations by direct sequencing in a new DNA sample from the patient, or by using restriction enzymes; (e) Validation of missense and intron changes by studies of co-segregation within the family, using bioinformatics tools and by verification of the absence of sequence change en 200 control alleles. Results: (a) A population was defined of n=139 patients without TPP1 or PPT1 enzyme deficiency; (b) n=56 skin, muscle biopsies and/or lymphocytes were analyzed by LM and TEM; © Vacuolated lymphocytes were identified by LM in 8 patients; (d) Classical morphotypes and variants of NCLs were described for n = 47 patients; (e) Characteristic ceroid/lipofuscin-like deposits were identified, with different ultrastructural patterns: curvilinear bodies and/or fingerprints profiles, alone or in combination, in 13 patients; (f) None of the patients showed intracellular granular osmiophilic deposits; (g) Ten new and 2 known sequence changes in exons and flanking intron regions of the CLN3, CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8 genes were identified, corroborated and recorded; (h) The presence of the most frequent deletion c. 461-280-677+382del966(e6-7) in the CLN3 gene was confirmed in 5 patients, 3 in homozygosis and 2 in heterozygosis, in 8 of the 12 alleles (66.67%); (i) Mutations of the CLN3 gene: c.400T>C = p.C134R (e6) and c.1197 G>T = p.E399X (e14) were described, analyzed and recorded for the first time; (j) Mutations of the CLN5 gene: c.291 insC = p.S98fs(e1) and c.1002-1006 of the AACA = p.K368SfsX15(e4) were described in two patients in homozygosis, and recorded for the first time; (k) The polymorphic nature of the sequence change in the CLN5 gene c.4C>T (e1) = p.R2C was confirmed in 3/96 alleles in a control population with a similar Latin American ethnic composition, with a relative frequency of 0.031; (l) Known polymorphisms were found in the CLN5, CLN6 y CLN7 genes; (m) In two Argentinean patients, four new changes were described in the CLN6 gene: p.R103W (e4),p.P184LfsX17 (e6), p.R252H (e7), c.486+8C>T (e/i4) in heterozygosis. Both patients presented the c.198+104T>C rs8025947 polymorphism; (n) Three patients presented sequence changes in the CLN7 gene, 2 known and one new, c.63-4del C (i2); (ñ) Two patients presented the same new change in the CLN8 gene: c.685C>G = p.P229A in homozygosis in exon 3; (o) Four new changes (nsSNPs) were analyzed for pathogenicity with at least four different bioinformatics tools; two were assessed as probably pathogenic, and two as probably benign or neutral. Discussion and Conclusions: (1) The methodology of analysis using algorithms agreed on by international consensus was adapted in line with the NCL Screening Program, and its systematic application resulted in a decrease in the lack of recognition of these conditions in the region under study. The geographical area of the genes studied and found for the first time in the region was expanded. The heterogeneity of the LA population and its European heritage are probably related to the occurrence of mutations known in the Northern hemisphere and new mutations attributable to the native population; (2) The CLN3, CLN5, CLN6, CLN7 y CLN8 genotypes were recognized for the first time in LA; (3) The validation of molecular genotypes using bioinformatics tools showed confluent results for assessing the pathological nature of the new missense mutations; (4) The molecular genetics of NCLs has proved to be more complex than it was initially thought when the first four genes were described in the '90s; (5) In 6 patients, the presence of mutations and/or polymorphisms was found in more than one gene, which leads to suspect that there is a complex network of relationships conditioning the occurrence and progression of symptoms; (6) In more than 50% of the patients enrolled in the CEMECO NCL Screening Program, a positive morphotype was identified; no changes were found in the coding and flanking intron regions under study. These patients are being assessed for participation in the search for new genes, in collaboration with international consortiums. There are many challenges to face on account of the complexity of the NCL diseases; the field with the highest social demand is the development of treatment strategies, which need to be based on the comprehensive characterization of patients. This dissertation work, carried out within the framework of the NCL Screening Program of CEMECO-Santísima Trinidad Children's Hospital, Province of Cordoba, is a contribution to that end.
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