| Summary: | RESUMEN Los ritmos circadianos son oscilaciones (conductuales o metabolicas) que presentan periodo cercano a un día, y que persisten en ausencia de señales externas, en condiciones constantes de iluminación y temperatura. Entre estos ritmos se han descripto, en corteza cerebral de rata y en hígado de hámster, oscilaciones en algunos fosfolípidos individuales y en los fosfolipidos totales, normalizados por cantidad de proteínas. Asimismo se han descripto ritmos en la marcación metabólica de fosfolípidos en diferentes tejidos, cultivos celulares primarios y lineas celulares inmortalizadas. En particular la actividad de la enzima CCT, de la vía de Kennedy de síntesis de fosfatidilcolina, tiene un patrón temporal circadiano de actividad in vitro. Sin embargo no hay ningún trabajo que aborde el estudio de la composición de las membranas celulares desde un enfoque circadiano y la regulación, a diferentes niveles, de la síntesis de fosfatidilcolina que es el fosfolípido mayoritario de las membranas celulares eucariotas. Por lo que se plantearon los objetivos de investigar si existen cambios temporales en la composición lipídica de las membranas celulares de hígado y testículos de ratón, comparar los resultados obtenidos a partir éstos con un sistema autónomo, libre de señales sistemicas pero de ritmicidad conocida, para lo cual se extendieron estos estudios a membranas de células NIH-3T3 y explorar diferentes niveles de regulación de la vía de síntesis mayoritaria de PC en órganos periféricos del ratón. Para alcanzar estos objetivos se tomaron muestras de los diferentes órganos de ratones sincronizados en ciclos de Luz-oscuridad (12:12), y luego mantenidos en diferentes condiciones de iluminación (luz-oscuridad y oscuridad constante). Se realizaron RT-PCR a tiempo final, PCR a tiempo real, western blot, mediciones de actividad enzimática CK y cuantificación de fosfolípidos fríos mediante TLC. Se observó que las membranas celulares en hígado de ratón y en células NIH 3T3 cambian su composición fosfolipídica de manera circadiana, siendo el cosciente PC/PE el indicador más robusto de dicho cambio, a pesar que no se detecten cambios en PC (ni en PE, en el caso de los fibroblastos en cultivo). En testículos no se observaron cambios en la composición de las membranas celulares, ni en la expresión de Bmall, ni en nigúna otra variable medida. En Hígado se encontró que solo el mensajero de CKa tiene un ritmo circadiano, y que está en fase con el de Bmall. A nivel de proteínas tampoco hay cambios en las isoformas de la CCTs y tampoco en la actividad enzimática CK. Los resultados del presente trabajo podrían proveer un explicación a las oscilaciones observadas en la actividad enzimática CCT en células NIH 3T3 (Acosta, Márquez, Guido en preparación), que estaría regulada por la composición de las membranas celulares, generándose un proceso regulatorio de retroalimentación, entre la actividad CCT y su propio producto. El caso de CKa muestra, por primera vez, la posibilidad de una enzima que oscila de manera circadiana en su mensajero pero no robustamente en su actividad enzimática, que es indicador de su cantidad, sin embargo no se puede descartar la posibilidad de que haya una regulación de su actividad que enmascare cambios en la cantidad de enzima total. También se puede conjeturar que el reloj molecular participa, de manera directa o indirecta, en los cambios temporales que ocurren en la composición fosfolipídica de las membranas celulares. Los antecedentes sugieren una regulación circadiana general de la síntesis de fosfolípidos, más que la de alguna vía de síntesis en particular. En este sentido las enzimas ATII (AGPAT), PAP y DGL, parecen ser candidatas a explicar este fenómeno de manera más acabada. La regulación transcripcional puede modificar la actividad enzimática específica y la síntesis o degradación de moléculas lipídicas pero no es suficiente para explicar la regulación de las cantidades netas y relativas de los fosfolípidos. Por lo que podrían existir otros mecanismos regulatorios que mantengan la homeostasis de las membranas celulares de manera global y/o en microdominios celulares particulares. En este sentido el transporte de PC por medio de ABCB4 parece tener importancia en la determinación de los cambios en la relación PC/PE en hígado de ratón.
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