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Modulación de la actividad de fosfatasa alcalina placentaria inducida por la organización dinámica de su entorno molecular
RESUMEN En la presente tesis se investigó la posible correlación entre la organización del entorno molecular de fosfatasa alcalina placentaria (FAP) en membrana y su actividad catalítica, considerando la posibilidad de utilizar a FAP como sonda para detectar cambios en la estructuración supramolecul...
|a Modulación de la actividad de fosfatasa alcalina placentaria inducida por la organización dinámica de su entorno molecular
246
|a p
260
|a Córdoba:
|b [s./n.],
|c 2010
300
|a 111 h.
|b ils. col.; grfs.; tbls.
502
|a Tesis (Grado Doctor en Ciencias Biológicas)--Universidad Nacional de Córdoba. Facultad de Ciencias Exactas, Físicas y Naturales. Biofísica Química-Cátedra de Química Biológica. Departamento Química.2010
520
|a RESUMEN En la presente tesis se investigó la posible correlación entre la organización del entorno molecular de fosfatasa alcalina placentaria (FAP) en membrana y su actividad catalítica, considerando la posibilidad de utilizar a FAP como sonda para detectar cambios en la estructuración supramolecular de ambientes molecularmente superpoblados en general y del glicocáliz celular en particular. Para esto se purificaron membranas placentarias enriquecidas en FAP con las que se prepararon filmes tipo Langmuir y Langmuir-Blodgett (LB) que se caracterizaron química, reológica y topológicamente. Se midió la actividad enzimática de FAP encontrándose un cambio en la cinética, de hiperbólica en vesículas a sigmoidal en ios LB. Posteriormente, con el objetivo de obtener un sistema experimental más simple desde el punto de vista de la composición y que permitiera disecar las características fundamentales de la actividad catalítica de FAP en su entorno molecular, se decidió simular el glicocáliz celular utilizando dpPE conjugado con polietilenglicoles de distinta longitud de cadena (PE-PEGs) y en mezcla con una matriz de fosfolípido. Se definieron las condiciones de miscibilidad de estos PE-PEGs con dpPC para poder seleccionar una composición que garantizara la estabilidad interfasial de la mezcla y así generar una situación de superpoblación molecular a nivel interfasial con la posibilidad de controlar el grado de empaquetamiento, y lograr alcanzar espesores variables. Tal como lo demostraron las isotermas de compresión rc-área y las microscopías de MEF y BAM, la región del pseudo-glicocáliz de la membrana modelo fue capaz de sufrir transiciones de fase como respuesta a los cambios en el empaquetamiento molecular de la interfase lipídica. Finalmente, se evaluó el efecto de la superpoblación molecular sobre la cinética de hidrólisis de FAP en las siguientes condiciones experimentales: a) FAP en solución con presencia de altas concentraciones de PEG soluble, b) FAP en filmes LB formados a partir de una monocapa mixta con dpPC mediante la adsorción de FAP solubilizada en la subíase, con el agregado al medio de incubación de PEG soluble, c) Filmes L-B mezcla dpPC/PE-PEG/FAP con los componentes sembrados directamente sobre la interfase agua-aire. En ninguno de estos casos fue posible reproducir la cinética sigmoidea de FAP en los LBMpp, lo cual permitió concluir que los efectos generados en la cinética de FAP por la incorporación en una interfase lipídica en presencia de agentes moleculares superpoblantes tanto en solución acuosa como conjugados a las interfases no alcanza a reproducir la complejidad del ambiente molecular de la membrana plasmática. Sin embargo, el comportamiento de los parámetros cinéticos de FAP (KM y Vmáx) mostraron ser sensibles tanto al grado de empaquetamiento como a la densidad molecular del agente superpoblante, ya sea en solución como anclado a la interfase, mostrando que la cinética enzimática es una muy buena herramienta para la caracterización de ambientes moleculares en sistemas complejos, ya que es capaz de sensar múltiples variaciones en las diversas condiciones ambientales y aún en espacios de diversas dimensionalidades y con restricción en los grados de libertad en los fenómenos difusionales (enzima en solución o enzima anclada a membrana).
